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严格的细胞周期调控是机体进行正常生理活动的功能保障,在人类癌症中普遍表现出细胞周期调节失控。Cyclin D1是细胞周期重要的驱动因子,在多种肿瘤细胞中都存在过度表达和活化。近年来,越来越多的证据显示以Cyclin D1作为肿瘤诊断与治疗的靶点具有很高的可行性。单链抗体以其高特异性、分子量小、易于工程化修饰等优势在肿瘤治疗中展示出巨大潜力。本课题组前期已成功筛选并制备了能够特异性识别细胞内Cyclin D1,并使其失活的单链抗体ADκ,通过体内外实验证明其具有较好的抑瘤作用。但由于单链抗体ADκ不能有效穿透细胞膜,导致其难以作用于细胞内靶标分子,从而极大地限制其应用。近年来研究较多的可作为递送载体的细胞穿膜肽,其高效、低毒的穿膜能力,为治疗药物的跨膜递送提供了新途径,也为抗体蛋白跨膜治疗提供了新思路。为此,本研究在课题组前期制备的单链抗体ADκ的基础上,分别将细胞穿膜肽Penetratin(PTN)和TAT连接在其C末端,构建具有穿膜肽序列的新型重组人ADκ蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT的两个原核表达载体,对其进行诱导表达、纯化得到含有细胞穿膜肽的重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT,ELISA分析发现新型重组融合蛋白与Cyclin D1有较好的亲和活性,从而为单链抗体ADκ进行抗肿瘤治疗奠定基础,推动抗体肿瘤临床治疗的进一步发展。具体结果如下:1.以实验室前期成功制备的抗Cyclin D1单链抗体(ADκ)的质粒为模板,通过PCR反应将细胞穿膜肽PTN和TAT分别克隆到单链抗体ADκ的C末端,获得具有穿膜肽序列的新型重组人ADκ的基因片段ADκ-PTN和ADκ-TAT,构建重组的原核表达载体及并制备分泌型表达菌pDF-ADκ-PTN/HB2151和pDF-ADκ-TAT/HB2151,通过对IPTG诱导后的培养基上清进行ELISA分析,确定穿膜肽Penetratin和TAT的修饰均不影响ADκ的抗原结合活性。2.为了得到大量融合细胞穿膜肽PTN和TAT的重组蛋白,将目的片段ADκ-PTN和ADκ-TAT分别与pET28b载体进行连接,成功构建重组表达载体pET28b-ADκ-PTN和pET28b-ADκ-TAT,并制备穿膜肽融合ADκ表达菌pET28b-ADκ-PTN/BL21(DE3)和pET28b-ADκ-TAT/BL21(DE3)。3.在0.5 mM IPTG,30℃条件下诱导4 h目的蛋白ADκ-PTN表达量最高,而ADκ-TAT在1 mM IPTG,30℃诱导4 h表达量最高,重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT有可溶性和包涵体两种表达形式且大部分以包涵体形式存在。4.采用8M脲变性及His Trap HP亲和层析纯化ADκ-PTN和ADκ-TAT包涵体,目的蛋白的最佳咪唑洗脱浓度为100 mM,洗脱液通过稀释复性和除盐后获得ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白。5.纯化的重组融合蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT经ELISA和Western blot鉴定,表明成功获得了具有较高生物学活性的穿膜肽融合ADκ蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT。6.纯化制备的ADκ-PTN和ADκ-TAT蛋白的抗原结合活性的ELISA结果表明,纯化的重组蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT能高特异性结合Cyclin D1,并且和单链抗体ADκ相比,与Cyclin D1的结合活性没有显著差异。细胞穿膜肽PTN和TAT与抗Cyclin D1单链抗体ADκ融合产生的重组蛋白ADκ-PTN和ADκ-TAT为基于胞内诱导或组织特异性Cyclin D1敲除的研究和ADκ抗体蛋白抗肿瘤治疗奠定了基础,此外也为以Cyclin D1为靶点的癌症的抗体治疗提供理论依据和新思路。