香樟齿喙象肠道细菌多样性及功能菌筛选

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肠道菌群在宿主昆虫体内发挥着不可替代的作用,特别是在与昆虫生长发育息息相关的营养吸收和解毒代谢等方面。香樟齿喙象Pagiophloeus tsushimanus是一种危害香樟Cinnamomum camphora的重要蛀干害虫,2014年首次被报道并被鉴定为中国新记录种。目前在上海市所辖的14个行政区均有分布,且呈现发生面积扩大、危害加重的趋势。香樟作为行道树、景观树和用材树种在上海地区广泛栽植,香樟齿喙象的危害严重影响了香樟的经济价值。香樟齿喙象以香樟的韧皮部和形成层等不易被昆虫直接分解的植物组织为食,其中富含樟脑、芳樟醇和桉叶油醇等萜类植物次生代谢物。目前在林间发现香樟是香樟齿喙象的偏好寄主,意味着该害虫可能已经进化出完整的适应性机制,以实现对营养物质的利用和有毒物质的代谢。因此,为明确肠道细菌在香樟齿喙象营养及解毒代谢上发挥的作用,本论文探究了香樟齿喙象肠道细菌的种类、群落结构、多样性及与环境的相关性,筛选具有纤维素分解及代谢保护功能的可培养细菌,为阐释肠道菌群对宿主昆虫的生理适应性和生态学意义提供理论依据,同时也为研究香樟齿喙象与寄主植物的协同进化关系以及香樟齿喙象对香樟的专食性为害特点提供一个新思路。主要研究结果如下:1、利用Illumina Miseq 16Sr DNA高通量测序技术,对香樟齿喙象不同发育阶段的肠道菌群结构及与生境菌群的差异进行了综合分析。在不同发育阶段共注释到19门,32纲,66目,105科,192属,细菌群落组成在不同发育阶段存在差异。变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)在香樟齿喙象不同虫态均有分布,其中以变形菌门为主。卵和成虫以肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为主,幼虫以链球菌科(Streptococcaceae)为优势菌科,无形体科(Anaplasmataceae)在蛹期丰度最高。在属水平上,沃尔巴克氏体属(Wolbachia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)和拉乌尔菌属(Raoultella)在所有发育阶段均被发现。菌群多样性从卵到成虫逐渐降低。肠道菌群与生境菌群结构具有相似性,肠杆菌科同为二者的优势菌科;但在次优势科和属级上存在差异,肠道菌群以无形体科和链球菌科为次优势菌科,而生境菌群以假单胞菌科为优势科。在属水平上,沃尔巴克氏体属是肠道菌群的优势属,泛菌属和假单胞菌属是生境菌群中的优势菌属。功能预测显示,肠道菌群与糖类、氨基酸代谢和膜转运相关通路密切相关。其次,发现与异源有毒物质降解和萜类、聚酮类化合物代谢相关通路。2、采用传统细菌分离培养方法并与16S r DNA技术相结合,分析了香樟齿喙象4龄幼虫肠道可培养细菌的群落结构,共分离出18株细菌,分属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),系统进化分析进一步证实了上述结论。其中,以变形菌门为优势菌门,占89%;变形菌门的16株细菌分属于2个目,肠杆菌目(Enterobacterales)占69%;假单胞菌目(Pseudomonadales)占31%;4个科,肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、欧文菌科(Erwiniaceae)、耶尔森菌科(Yersiniaceae)和假单胞菌科(Pseudomonadaceae);6个属,假单胞菌属(Pseudomonas)5株,肠杆菌属(Enterobacter)3株,克雷伯菌属(Klebsiella)3株,泛菌属(Pantoea)3株,拉乌尔菌属(Raoultella)1株,沙雷氏菌属(Serratia)1株,以假单胞菌属为优势菌。厚壁菌门和放线菌门占比较少;厚壁菌门1株,隶属于芽孢杆菌属(Bacillus);放线菌门1株,隶属于短状杆菌属(Brachybacterium)。3、通过刚果红染色法从香樟齿喙象4龄幼虫肠道内筛选出11株具有纤维素分解能力的共生细菌,测定四种纤维素酶活力,从中挑选出酶活力最高的菌株C4,对其纤维素酶学特性及产酶条件进行研究。结果表明,菌株C4在羧甲基纤维素钠培养基上D/d值最大(12.51±0.49 mm)且与其他菌株具有显著差异。测定11株细菌四种纤维素酶活力,结果显示,菌株C4相比其他菌株具有突出的纤维素酶活力。对菌株C4的形态学特征及分子鉴定结果显示,菌株C4为泛菌属(Pantoea)细菌。此外,以菌株C4为研究对象,对其纤维素酶反应条件(p H、温度和时间)及菌株产酶条件(p H、接种量、碳源和氮源)进行优化。研究发现,菌株C4产酶发酵最佳培养时间为6 d;酶反应最适p H为5.6;酶反应最适温度为40℃;在45~65℃反应20 min条件下具有较好的热稳定性。此外,菌株C4产酶的菌液最佳p H为5.0,最适p H范围为5.0~7.0;菌液接种量为20%时产酶活力最高;菌株C4在以常见农业废弃物秸秆为底物时,酶活力较高,并显著高于其他碳源,其中以大豆秸秆效果最好;酵母提取物作为有机氮源时菌株C4的产酶活力最高。从香樟齿喙象幼虫肠道中分离到的纤维素分解细菌可能在宿主昆虫对食物的转化和营养利用方面发挥作用。4、分别利用添加樟脑、桉叶油醇和芳樟醇作为唯一碳源的无机盐培养基,筛选香樟齿喙象4龄幼虫肠道中的可降解细菌,进而通过气相色谱分析测定各菌株对樟脑、桉叶油醇和芳樟醇的降解能力。结果表明,分离出的10株降解菌分别为樟脑降解菌5株、桉叶油醇降解菌3株和芳樟醇降解菌2株。樟脑降解菌的数量和种类最为丰富。分别为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、Pluralibacter gergoviae、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和Corynebacterium variabile。其中,铜绿假单胞菌和P.gergoviae两种细菌均可以降解樟脑、桉叶油醇和芳樟醇。铜绿假单胞菌对芳樟醇的降解率最高,对樟脑的降解能力最低。P.gergoviae对樟脑、桉叶油醇和芳樟醇三者的降解能力与铜绿假单胞菌一致,对桉叶油醇和芳樟醇的降解能力高于樟脑。粘质沙雷氏菌仅从樟脑和桉叶油醇中分离到,且对二者均有一定的降解能力。放线菌门棒状杆菌属细菌C.variabile对樟脑的降解率最高,但在桉叶油醇和芳樟醇培养基中未筛选到该细菌。表明香樟齿喙象肠道菌群可能在寄主香樟植物次生代谢物降解上发挥作用,且肠道菌群可能与宿主昆虫取食的寄主植物相关。
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