萝卜(Raphanus sativus L.)是一种重要的十字花科根菜类作物,具有较高的营养价值,在中国乃至世界都有广泛种植。硫代葡萄糖苷是一种重要的植物次生代谢产物,主要存在于萝卜等十字花科植物中。硫苷及其降解产物在植物防御、风味形成以及人类癌症预防中起重要的作用,此外,它还具有作为生物农药的潜力。MYB转录因子MYB28、MYB29、MYB76等是硫苷生物合成过程中的关键调控基因,其表达量的多少直接影响萝卜中硫苷的含量和分布。调控基因的某些特性在拟南芥、花椰菜、芥菜、小白菜、大白菜等十字花科作物已有广泛研究,然而在萝卜研究领域关于MYB28和MYB29的分子特性、表达特征尚未见报道。因此,本论文以萝卜品种’NAU-ZQH’为材料,通过比对拟南芥中MYB28和MYB29的序列与本实验室萝卜转录组序列,克隆萝卜中调控硫苷合成的两个关键基因RsMYB28和RsMYB29,之后从亚细胞定位、转录激活活性和表达特征等多方面进行研究,以期,增加对萝卜中RsMYB28和RsMYB29基因分子特性和表达特征的认识,为后期通过基因改良培育出硫苷含量较高的萝卜新品种提供理论基础。本研究主要结果如下：1.通过比对,对拟南芥中MYB28和MYB29的序列以及参照本实验室萝卜转录组序列设计出两对特异引物RsMYB28F1/R1和RsMYB29F1/R1,从萝卜中分离得到RsMYB28和RsMYB29的DNA和cDNA全长。其中RsMYB28基因组DNA和cDNA全长分别为1836 bp和1614 bp,包括1092 bp的开放阅读框(ORF),编码363个氨基酸。RsMYB29基因组DNA全长1493 bp,包含3个外显子和2个内含子,cDNA全长1093 bp,包括1023bp的开放阅读框(ORF),编码340个氨基酸。蛋白质三维结构显示两个基因都含有典型的DNA结合结构域。序列比对及进化树分析表明,RsMYB28和RsMYB29都与芥菜和甘蓝在同一分支上,且与白菜和拟南芥具有较高同源性。同时利用染色体步移法克隆这两个MYB基因的启动子序列,得到的RsMYB28基因5’侧翼序列1257 bp, RsMYB29基因5’侧翼序列576 bp。启动子元件分析显示,RsMYB28和RsMYB29基因启动子序列包含多个光应答相关元件,此外RsMYB28基因启动子还具有乙烯、赤霉素、干旱、抵御和胁迫响应相关的逆境胁迫响应元件,RsMYB29基因启动子还含有干旱、水杨酸生物钟等响应元件。2.利用qRT-PCR技术对两个基因进行表达分析显示,RsMYB28和RsMYB29基因的转录表达水平在种子和膨大前期表达量最高,膨大盛期表达量最小,RsMYB28基因表达量较大的部位为茎和叶片。RsMYB29基因除了膨大盛期,表达量较大的部位为根和叶片。不同处理下的表达特性分析显示,创伤、葡萄糖和ABA处理促进RsMYB28基因的表达,RsMYB29基因的在创伤、MeJA和葡萄糖处理后表达量增加。同时构建了过表达载体pCAMBIA1301-RsMYB28和pCAMBIA1301-RsMYB29,并成功转入农杆菌。3.构建载体pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29,转化至酵母菌株Y2H,接种于SD/-Trp培养基培养。最后分别接种于SD/-His-Ade和SD/X-α-gal培养基中观察酵母生长情况,结果发现含有pGBKT7-RsMYB28和pGBKT7-RsMYB29质粒的菌株能正常生长并在SD/X-α-gal培养基中显示蓝色,说明RsMYB28和RsMYB29在酵母中具有转录激活活性。构建绿色荧光蛋白融合载体,通过基因枪法将构建载体转化至洋葱表皮,结果显示,RsMYB28和RsMYB29蛋白都定位在细胞核上。