B链去四肽胰岛素(DTI)被证明是单体速效胰岛素,在中性溶液中,其浓度高于0.6mmol/L时仍然保持单体性质,可以在注射进入血液后快速起到降低血糖浓度的作用,具有较高的药用价值. 本文阐述了用毕赤酵母(Pichiapastoris)表达DTI前体MIP,并通过胰蛋白酶和羧肽酶B两步连续酶切得到DTI的方法。MIP最高发酵表达量达到150mg/L.发酵液中MIP通过疏水层析,分子筛初步纯化后直接进行酶切,在胰蛋白酶酶切3h后加入抑制剂p-Aminobenzamidine处理l5 min,然后直接加入羧肽酶B酶切6h,再通过反相柱纯化即可得到纯品DTi.从分子筛到最后DTI,纯化总得率达到77％.按中国药典小白鼠惊厥法测得DTI的生物活性为22 IU/mg,是胰岛素的80％.在Superdex 75 (HR 10/30)分子筛上测定DTI的解离聚合曲线,证明其是单体. 由于单体胰岛素前体表达量低,本文运用两种方法来探寻单体速效胰岛素前体在甲醇毕赤酵母中表达量的决定因素,运用real-time PCR方法证明基因拷贝数并不是决定胰岛素前体的表达量的因素,通过对前体解离聚合性质测定,发现单体速效胰岛素前体也为单体,而野生型胰岛素前体却是聚合体,推测出前体的物理性质决定表达量. 最后,运用基因工程的方法,修饰了MIP的结构,增加了一段九肽,得到新的前体为GEMIP,增加了前体的表达量,并且用Superdex 75(HR 10/30)分子筛测定到GEMIP的聚合性质高于MIP,证明了前体的聚合性质决定前体的表达量这一推测.