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第一部分肺腺癌患者EGFR-TKIs耐药临床研究目的:通过对晚期初治肺腺癌患者表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)治疗耐药前后病例资料和基因检测结果进行回顾性研究,分析肺腺癌患者具有EGFR突变患者的临床特征,研究肺腺癌EGFR敏感型突变患者一线EGFR-TKIs治疗的中位无进展生存时间(progression-free survival,PFS)和常见耐药机制。方法:1.选取2017年1月至2017年12月期间就诊于河北医科大学第四医院东院肿瘤免疫科和呼吸内科ⅢB-Ⅳ期肺腺癌患者171例,根据EGFR基因检测结果分为EGFR突变型组(EGFR-MUT)及EGFR野生型组(EGFR-WT),分析肺腺癌EGFR突变与患者性别、年龄、吸烟史及TNM分期等临床特征关系。2.选取上述EGFR敏感突变型外显子19缺失(19 del)和外显子21错义突变(L858R)肺腺癌患者71例,一线给予表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂EGFR-TKIs治疗,按照实体瘤的疗效评价标准1.1版(Response Evaluation Criteriain Solid Tumors,RECIST version 1.1),规律复查评估,分析肺腺癌一线EGFR-TKIs治疗中位PFS。3.选取上述EGFR-TKIs治疗组中耐药后行二次基因检测肺腺癌患者59例,根据患者基因检测结果,分析我院EGFR-TKIs耐药患者基因表达变化情况及其比例。结果:1.在所有入组的171例晚期肺腺癌患者中,EGFR突变患者共87例,占患者总人数的50.9%。其中EGFR 19del突变患者42例(48.3%),EGFR L858R突变患者35例(40.2%),其他类型突变患者共10例(11.5%)。EGFR突变患者中,女性患者54例,男性患者33例(62.1%vs.37.9%,P<0.001);既往有吸烟史患者20例,不吸烟患者67例(23.0%vs.77.0%,P=0.002);>65岁患者34例,≤65岁患者53例(39.1%vs.60.9%,P=0.434);ⅢB/C期患者14例,Ⅳ期患者73例(16.1%vs.83.9%,P=0.200)。以上结果表明,肺腺癌EGFR突变与患者的性别、吸烟史相关,与年龄及TNM分期无关。2.EGFR敏感突变型晚期肺腺癌患者中,一线给予EGFR-TKIs治疗患者共71例。其中口服盐酸埃克替尼患者37例(52.1%),口服吉非替尼患者23例(32.4%),口服盐酸厄洛替尼患者11例(15.4%)。肺腺癌患者一线EGFR-TKIs治疗中位PFS为10.6个月(95%CI 9.8-11.4),其中3例患者尚未达到PFS。3.在上述EGFR敏感突变型晚期肺腺癌患者中有68例患者出现耐药而病情进展,其中59例(86.7%)患者行二次血液学或组织学基因检测。基因检测患者中,发生T790M突变患者32例(54.8%),发生MET扩增患者3例(5.1%),发生HER2扩增患者1例(1.7%)。但仍有23例(38.9%)患者耐药机制不明。T790M突变为肺腺癌患者EGFR-TKIs治疗耐药的主要机制。结论:1.肺腺癌患者EGFR突变与患者的性别、吸烟史相关,与发病年龄及TNM分期无关。不吸烟、女性患者突变率高。2.具有EGFR敏感型突变的晚期肺腺癌患者一线给予EGFR-TKIs治疗的中位PFS为10.6个月,T790M突变为主要的耐药机制,其次为MET和HER2扩增,38.9%患者耐药机制不明。第二部分BIN1在肺腺癌EGFR-TKIs耐药细胞中的表达及意义目的:检测桥接整合因子-1(bridging interator-1,BIN1)在EGFR 19del的细胞系PC-9及吉非替尼耐药细胞系PC-9/GR中的表达情况;构建BIN1过表达的真核重组质粒,通过转染质粒建立PC-9/GR细胞系过表达BIN1细胞,研究BIN1表达影响肺腺癌吉非替尼耐药的可能机制。方法:1.倒置显微镜观察PC-9和PC-9/GR细胞形态学变化。2.实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR)及Western blotting分别检测肺腺癌细胞系PC-9和PC-9/GR中BIN1的表达情况。3.构建真核表达重组质粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin-BIN1和空白对照质粒CMV-MCS-GFP-SV40-Neomycin,利用大肠杆菌扩增质粒。体外通过脂质体转染的方式将BIN1基因转入PC-9/GR细胞(BIN1),并同时设空转染组(NC)及空白对照组(Con)。通过qRT-PCR及Western blotting鉴定BIN1转染效率。4.MTT实验检测BIN1对PC-9/GR细胞增殖能力的影响。5.平板克隆形成实验检测BIN1对PC-9/GR细胞克隆形成能力的影响。6.细胞流式实验检测BIN1对PC-9/GR细胞凋亡能力的影响。结果:1.与EGFR敏感突变型PC-9细胞相比,吉非替尼耐药的PC-9/GR细胞形态增大,透光度减低,呈梭形,可见融合的巨型细胞,细胞内可见空泡。2.qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与EGFR 19del的PC-9细胞相比,PC-9/GR细胞中BIN1 mRNA和蛋白呈低表达状态(P<0.05)。3.构建BIN1过表达的真核重组质粒,通过转染质粒建立PC-9/GR细胞系过表达BIN1细胞。qRT-PCR和Western blot实验结果表明,与NC组和Con组相比,BIN1转染组PC-9/GR细胞中BIN1基因和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);而NC组和Con组中BIN1基因和蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05),说明BIN1已成功转入PC-9/GR细胞中。4.MTT实验结果表明,与NC组和Con组相比,BIN1组PC-9/GR细胞在含吉非替尼浓度(μmol/L)分别为0.1、0.2、0.5、1、5、10、20的DMEM中的存活率明显降低(P<0.05),而NC组和Con组细胞的存活率相比差异无统计学意义(P>0.05),说明BIN1可以抑制PC-9/GR的增殖能力。5.平板克隆形成实验结果表明,相同条件培养7天后,BIN1组细胞克隆形成能力显著降低,为NC组的31%(P<0.05),Con组的28%(P<0.05),而NC组和Con组细胞的克隆形成能力相比差异无统计学意义(P>0.05)。说明BIN1过表达可以抑制PC-9/GR细胞的克隆形成能力。以上MTT及平板克隆形成实验结果表明BIN1可以恢复PC-9/GR的对吉非替尼药物的敏感性。6.细胞凋亡实验结果表明,BIN1组处于凋亡期PC-9/GR细胞比例为(10.47±1.23)%,NC组和Con组处于凋亡期的细胞分别为(3.79±0.51)%和(3.06±0.22)%,BIN1组处于凋亡期细胞比例显著增加(P<0.05),而NC组和Con组相比差异无统计学意义(P>0.05),说明过表达BIN1可促进吉非替尼诱导的PC-9/GR细胞的凋亡。结论:1.抑癌基因BIN1在人肺腺癌EGFR敏感型突变的PC-9细胞吉非替尼耐药后表达水平降低。2.吉非替尼耐药PC-9/GR细胞过表达BIN1后,可恢复其对吉非替尼治疗的敏感性,吉非替尼通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。