过氧化物酶(Peroxidase, POD)是一类广泛存在于细菌,真菌,植物和动物中的氧化还原酶,可利用过氧化氢来介导多种无机和有机底物的氧化.大多POD是单一多肽链与含Fe(Ⅲ)-原卟啉IX辅基构成的血红素蛋白,多肽链分子须与血红素结合才构成全酶,血红素辅基是POD电子传递的载体.III类POD是来源于植物的分泌型过氧化物酶,在胞质中合成后可以转运至细胞壁或液泡,参与多种生理功能,如机体内毒性过氧化物的清除,细胞壁的合成,伤口愈合,生长素合成及代谢等.已报道含血红素辅基的蛋白(肌红蛋白,细胞色素c等)可以在H2O2存在的条件下对DNA进行氧化断裂.PmPOD是来源于黍子中的一种含血红素辅基的阳离子过氧化物酶,可以诱导结直肠癌细胞发生坏死性凋亡(Necroptosis),PmPOD诱导的坏死性凋亡与PmPOD造成DNA的断裂有关.因此本论文将着重研究PmPOD对DNA的断裂及其机制.
　　本研究首先利用琼脂糖凝胶电泳技术,以pBR322,pUC18和pGEM-T为底物,并结合DTT,NaN3,以及二价金属离子等试剂初步研究PmPOD是否可以断裂DNA;通过连接和转化实验以及光谱扫描的方法探究PmPOD切割DNA的分子机制,即证实PmPOD诱导DNA断裂是水解断裂,还是氧化断裂,并进一步以dNMPs等为底物,通过HPLC分析PmPOD对dNMPs的水解作用;在上述研究基础上,分别测定了PmPOD过氧化物酶和磷酸酶活性的最适pH值;最后通过X射线晶体学方法解析得到了PmPOD的三维结构;结合PmPOD的氨基酸序列,分析了PmPOD发挥磷酸酶活性的活性位点.
　　实验结果表明,在一定时间及浓度范围内,PmPOD通过类似于天然核酸内切酶的切割机制将超螺旋环状DNA切割成缺刻型和线状DNA,而在高浓度PmPOD及长时间作用时,可以将质粒DNA完全降解.连接转化实验表明,PmPOD以水解的方式断裂质粒DNA,抑制和光谱扫描实验表明,活性氧(ROS)和铁卟啉IX辅基均不参与PmPOD介导的DNA切割,说明PmPOD与其它报道的血红素蛋白(肌红蛋白等)不同,其通过水解而不是氧化断裂机制切割DNA.二价金属离子实验表明,与其它内切核酸酶类似,Mg2+显著增强PmPOD的DNA切割活性.进一步的研究表明,PmPOD可以水解脱去dNMPs的磷酸根,表明PmPOD具有磷酸酶活性.随后将PmPOD与辣根过氧化物酶(HRP)进行比较,结果发现,PmPOD的磷酸酶活性远高于HRP,但过氧化物酶活性低于HRP.本研究通过X射线晶体衍射技术获得了PmPOD的三维结构,通过对PmPOD和其它粮食作物来源POD的氨基酸序列比较分析发现,PmPOD序列中包含一段HCXXXXXR保守序列,该序列与已报道的双特异性磷酸酶(DUSPs)的活性位点相似.该研究为该类过氧化物酶切割DNA的机制提供了有力支撑,并为进一步研究其在酶学方面的研究提供了参考价值.