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研究背景:帕金森病(Pakinson’s disease,PD)是发病率仅次于阿尔茨海默症的第二大神经退行性疾病,其主要病理特征是中脑黑质(substantia nigra,SN)致密带多巴胺(dopamine,DA)能神经元损伤引起的纹状体(striatum,Str)分泌DA的减少。已有研究证明多个脑肠肽与中枢DA能神经系统的功能密切相关。Nesfatin-1是2006年由日本学者Shinsuke Oh-I发现的一种新的脑肠肽,nesfatin-1的主要生理功能是抑制进食和调节能量代谢,我们前期研究发现nesfatin-1能拮抗鱼藤酮引起的MES 23.5细胞损伤。在细胞和动物实验中,nesfatin-1能拮抗1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methyl-4-phenylpyridillium ion,MPP~+)诱导的MES 23.5多巴胺能细胞损伤和MPTP引起的小鼠中脑黑质DA能神经元的损伤,上述作用与nesfatin-1通过C-Raf-ERK信号通路发挥的保护线粒体功能、拮抗细胞凋亡作用有关。研究目的:以上研究证明了外源性nesfatin-1对黑质DA能神经元具有神经保护作用,有文献报道在PD病人血液中nesfatin-1的含量低于正常对照组。那么,当中枢神经系统内缺乏nesfatin-1时,是否会引起中脑黑质多巴胺-纹状体系统的损伤呢?研究方法:为阐明nesfatin-1在维持中脑黑质DA能系统正常生理功能中的作用,本研究观察了在小鼠侧脑室注射nesfatin-1抗体引起脑室内nesfatin-1含量下降时,中脑黑质多巴胺-纹状体系统的改变。我们采用8周龄C57BL/6雄鼠,对其实施侧脑室埋管术,再将已埋好管的小鼠随机分为4组,分别为:(1)对照组:侧脑室注射生理盐水;(2)Anti-nesfatin-1组:侧脑室注射0.12 mg/m L的nesfatin-1抗体;(3)IgG抗体对照组:侧脑室注射小鼠单克隆IgG1κ抗体,MAB 201;(4)MC4R受体抑制剂组:侧脑室注射黑皮质素4受体(Melanocortin 4 Receptor,MC4R)抑制剂,SHU9119;以上各组小鼠均侧脑室药物注射14天。之后应用爬杆实验检测小鼠的平衡调节能力和肢体协调能力;应用免疫荧光染色法检测SN区酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)免疫阳性细胞数目的变化;应用辣根过氧化氢酶DAB显色法来检测Str区TH阳性细胞神经纤维数量的变化;应用透射电镜来检测DA能神经元内线粒体数目、长轴长度以及神经元内细胞核形态变化;应用高效液相色谱检测技术(High-performance liquid chromatography,HPLC)检测Str区DA及其代谢产物二羟基苯乙酸(Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC)和高香草酸(Homovanillic acid,HVA)含量的变化;应用Western blot技术检测SN区caspase-3及p-ERK/GAPDH蛋白比值变化情况。应用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测SN脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的含量。研究结果:1.小鼠侧脑室注射药物前与药物注射14天后比较各组小鼠实验前后体重变化情况,结果显示对照组、Anti-nesfatin-1组、IgG抗体对照组和MC4R受体抑制剂组内小鼠实验前后体重无明显变化(p>0.05)。2.小鼠侧脑室持续给药14天后,采用爬杆实验来检测各组小鼠平衡调节能力和肢体协调能力的变化,对照组、Anti-nesfatin-1组、IgG抗体对照组、MC4R受体抑制剂组小鼠从杆顶到杆底所用平均时间分别为4.9s、5.2s、5.6s、5.2s,结果显示各组小鼠运动时间无明显变化(p>0.05),提示侧脑室注射nesfatin-1抗体未引起小鼠出现运动障碍。3.小鼠侧脑室持续给药14天后,Anti-nesfatin-1组小鼠SN区TH免疫阳性细胞数量与对照组、IgG抗体对照组相比分别下降了23%和30%,差异均具有统计学意义(p<0.05)。以上结果显示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠SN区DA能神经元数量明显减少。4.通过对Str进行TH+免疫组织化学染色来观察黑质DA神经细胞投射到Str的神经末梢数量是否发生改变。免疫组织化学染色结果显示,小鼠侧脑室注射0.12mg/ml Anti-nesfatin-1 14天后,TH+神经末梢纤维的数量明显减少。提示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠黑质DA神经细胞投射到Str的神经末梢数量明显减少。5.小鼠侧脑室持续给药14天后,HPLC结果显示,Anti-nesfatin-1组DA含量与对照组相比下降了28%;与IgG抗体对照组相比下降了22%;与MC4R受体抑制剂组相比下降了29%,差异均具有统计学意义(p<0.05)。0.12 mg/mL Anti-nesfatin-1组HVA含量与对照组相比下降了27%;与IgG抗体对照组相比下降了22%;与MC4R受体抑制剂组相比下降了19%,差异均具有统计学意义(p<0.05)。对照组、Anti-nesfatin-1组、IgG抗体对照组和MC4R受体抑制剂组内DOPAC含量之间相比均无统计学差异(p>0.05)。以上结果显示当中枢神经系统内nesfatin-1含量减少时能够导致小鼠Str区DA及其代谢产物HVA含量明显减少。6.小鼠侧脑室持续给药14天后,通过透射电镜来观察SN区DA能神经元内线粒体数目、长轴长度以及其神经元内细胞核形态变化。结果显示与对照组相比,Anti-nesfatin-1组线粒体数目下降了54%,线粒体长轴长度减少了9%(p<0.05),差异具有统计学意义(p<0.05),与对照组相比,Anti-nesfatin-1组DA能神经元内细胞核发生明显皱缩。以上结果显示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠DA能神经元内线粒体发生不同程度的损伤。7.小鼠侧脑室持续给药14天后,与对照组和IgG抗体对照组相比,Anti-nesfatin-1组SN中caspase-3蛋白含量分别升高了57%和102%,差异均具有统计学意义(p<0.05),提示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠SN区细胞凋亡因子caspase-3的含量升高,诱发细胞凋亡。8.小鼠侧脑室持续给药14天后,Anti-nesfatin-1组与对照组相比p-ERK/GAPDH的水平升高44%,与IgG抗体对照组相比升高34%,差异均具有统计学意义(p<0.05)。以上结果显示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠SN区p-ERK的含量升高。9.小鼠侧脑室持续给药14天后,Anti-nesfatin-1组SN区BDNF的含量与对照组相比升高了89%,与IgG抗体对照组相比升高了41%,与MC4R受体抑制剂组相比升高了89%,差异均具有统计学意义(p<0.05)。提示侧脑室注射nesfatin-1抗体能够导致小鼠SN区BDNF的含量升高,对细胞损伤产生部分代偿反应。结论:与我们前期已发表的研究显示的外部给予nesfatin-1对MPP~+和MPTP造成的DA能神经元损伤的保护作用一致,当侧脑室给予Anti-nesfatin-1,造成中枢神经系统内nesfatin-1含量降低时,能够诱导小鼠黑质纹状体DA系统的损伤,提示nesfatin-1对维持黑质纹状体系统的正常生理功能具有重要作用,并且nesfatin-1可作为神经退行性疾病的早期干预药物之一,对预防和延缓神经退行性疾病的发生具有重要的潜在临床应用价值。