1.研究目的本文旨在通过“以时测脏”的研究方法,即在中医“天人相应”观指导下,根据中医五脏与四时变化相通应的特点。通过观察比较四时变化中对照组金黄地鼠和实验组(摘除松果体)金黄地鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamus-Pituitary-Adrenal axis,HPA)各组织中相关生物钟基因和细胞信号转导因子的季节变化特点,进一步揭示“肾应冬”生物学机制,探讨中医肾藏象的本质内涵。2.研究方法2.1动物实验选用8周龄SPF级雄性叙利亚金黄地鼠,体重120g±20g,分别于春分、夏至、秋分、冬至前5周从北京维通利华实验动物技术有限公司购入。随后将金黄地鼠随机分为对照组与实验组,每组8只。实验组进行松果体摘除手术,对照组不做任何处理。在相同饲养条件下饲养至春分、夏至、秋分、冬至当日,于当日20:00移至暗室,21:00开始取材,分别取出各组金黄地鼠下丘脑、垂体、肾上腺组织,用蛋白质免疫印迹(Western Blot)法检测各组织中生物钟基因和细胞信号转导因子的蛋白表达情况。2.2指标检测2.2.1四季变化对金黄地鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴生物钟基因per1、per2的影响2.2.2四季变化对金黄地鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴G蛋白Gi、Gs的影响2.2.3四季变化对金黄地鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴细胞信号转导因子c-fos、c-jun的影响2.3统计分析方法计量结果均以均数±标准差((?)± s)表示,采用SAS 8.0进行统计分析,组间采用单因素方差分析;两两比较时,用独立样本t检验,或2个独立样本的非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。3.研究结果3.1 HPA轴各组织中生物钟基因per1、per2蛋白表达的四季变化3.1.1下丘脑组织中生物钟基因per1、per2蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠下丘脑组织per1蛋白表达四季变化趋势为春>秋>冬>夏,实验组下丘脑组织per1蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏。②对照组金黄地鼠下丘脑组织per2蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏,实验组下丘脑组织per2蛋白表达四季变化趋势为秋>冬>夏>春。3.1.2垂体组织中生物钟基因per 2蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠垂体组织per2蛋白表达四季变化趋势为春>冬>秋>夏,实验组金黄地鼠垂体组织per2蛋白表达四季变化趋势为春>秋>冬>夏。3.1.3肾上腺组织中生物钟基因per1、per2蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠肾上腺组织per1蛋白表达四季变化趋势为夏>冬>春>秋,实验组金黄地鼠肾上腺组织per1蛋白表达四季变化趋势为秋>夏>冬>春。②对照组金黄地鼠肾上腺组织per2蛋白表达四季变化趋势为夏>秋>春>冬,其中春、夏、秋三季与冬季相比有显著差异,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.001);实验组金黄地鼠肾上腺组织per2蛋白表达四季变化趋势为春>夏>秋>冬。3.2 HPA轴各组织中细胞信号转导因子c-fos、c-jun蛋白表达的四季变化3.2.1下丘脑组织中细胞信号转导因子c-fos、c-jun蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠下丘脑组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏,实验组金黄地鼠下丘脑组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏。②对照组金黄地鼠下丘脑组织c-jun蛋白表达四季变化趋势为春>秋>冬>夏,其中夏、冬季两季与春季相比有显著差异,差异有统计学意义(P<0.05);实验组金黄地鼠下丘脑组织c-j un蛋白表达四季变化趋势为秋>春>冬>夏,其中实验组春与对照组春相比存在明显差异,差异有统计学意义(P<0.05)。3.2.2垂体组织中细胞信号转导因子.c-fos、c-j un蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠垂体组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏,其中春夏、秋三季与冬季相比有显著差异,且有统计学意义(P<0.05,P<0.01);实验组金黄地鼠垂体组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为夏>春>秋>冬,其中实验组冬季与对照组冬季相比差异显著,且有统计学意义(P<0.01)。②对照组金黄地鼠垂体组织c-jun蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏,其中春、夏两季与冬季相比差异显著,且有统计学意义(P<0.05);实验组金黄地鼠垂体组织c-jun蛋白表达四季变化趋势为秋>冬>春>夏。3.2.3肾上腺组织中细胞信号转导因子c-fos、c-j un蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠肾上腺组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏,实验组金黄地鼠肾上腺组织c-fos蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏。②对照组金黄地鼠肾上腺组织c-jun蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏,其中夏季与冬季相比有显著差异,差异有统计学意义(P<0.05);实验组金黄地鼠肾上腺组织c-jun蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏。3.3 HPA轴各组织中细胞信号转导因子Gi、Gs蛋白表达的四季变化3.3.1下丘脑组织中细胞信号转导因子Gi、Gs蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠下丘脑组织Gi蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏,实验组金黄地鼠下丘脑组织Gi蛋白表达四季变化趋势为春>夏>冬>秋。②对照组金黄地鼠下丘脑组织Gs蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏,其中春、夏两季与冬季相比差异显著,且有统计学意义(P<0.05);实验组金黄地鼠下丘脑组织Gs蛋白表达四季变化趋势为夏>春>秋>冬,其中实验组夏与对照组夏相比差异显著,有统计学意义(P<0.05)。3.3.2肾上腺组织中细胞信号转导因子Gi、Gs蛋白表达的四季变化①对照组金黄地鼠肾上腺组织Gi蛋白表达四季变化趋势为冬>秋>春>夏,实验组金黄地鼠肾上腺组织Gi蛋白表达四季变化趋势为冬>春>秋>夏。②对照组金黄地鼠肾上腺组织Gs蛋白表达四季变化趋势为夏>秋>春>冬,其中夏季与冬季相比差异显著,且有统计学意义(P<0.05);实验组金黄地鼠肾上腺组织Gs蛋白表达四季变化趋势为春>夏>秋>冬,其中实验组春与对照组春相比有显著差异,且差异有统计学意义(P<0.05)。4.结论(1)本研究首次证实了下丘脑、垂体、肾上腺组织的生物钟基因per1、per2具有一定的季节节律性,并且生物钟基因per1、per2参与了下丘脑-垂体-肾上腺轴对机体的调控过程。“肾应冬”的规律与下丘脑-垂体-肾上腺轴生物钟基因的季节性节律变化密切相关。(2)中医“肾应冬”生理机制与下丘脑-垂体-肾上腺轴褪黑素的变化,G蛋白介导和第三信使c-fos、c-jun参与的细胞信号转导系统密切相关。