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目的:肥胖是一种严重危害公共健康的代谢性疾病,并显著增加了 2型糖尿病及代谢综合征的发病风险。糖皮质激素(GCs)是一种肾上腺皮质分泌的类固醇激素,能够调节糖及脂肪代谢。过多的GCs生成或摄入能够诱发肥胖及代谢综合征。1lβ-HSD1依赖内质网腔内NADPH能够促进组织GCs的生成,并已成为肥胖及代谢综合征的主要发病因素。已糖-6-磷酸脱氢酶(H6PDH)是内质网腔内生成NADPH的关键酶,进而影响了组织11β-HSD1的活性。然而,H6PDH在调节脂肪组织GCs的生成及其在肥胖及胰岛素抵抗发生中的作用及分子机制目前仍不明确。本研究拟利用脂肪组织特异性H6PDH过表达和敲除小鼠模型,观察小鼠代谢表现型变化,并探索脂肪组织H6PDH在调节脂肪GCs代谢及其诱发的肥胖、胰岛素抵抗发生中的作用及分子机制,为临床预防、治疗肥胖及代谢综合征的发生提供新的靶点及理论基础。方法:1.脂肪H6PDH过表达在诱发腹部肥胖及胰岛素抵抗中的作用及分子机制利用本实验组已经建立的脂肪组织H6PDH过表达(aP2-H6PDH-Tg)小鼠模型,将孵育的小鼠进行基因型分析,确定脂肪组织H6PDH过表达(aP2-H6PDH)鼠及野生型对照组(WT)雄性小鼠。分别给予正常饮食及高脂饮食喂养,即分组为:aP2-H6PDH小鼠+正常饮食;aP2-H6PDH小鼠+高脂饮食;WT对照组小鼠+正常饮食;WT对照组+高脂饮食;并完成GTT及ITT测定。喂养至24周将小鼠处死,收集血样、脂肪组织及非脂肪组织标本。1)记录小鼠体重、脂肪重量、糖耐量及胰岛素敏感性的改变。2)测定血浆皮质酮、游离脂肪酸水平。3)应用油红O染色观察脂肪滴形态。4)测定脂肪组织皮质酮水平、H6PDH及11β-HSD1的酶活性。5)应用实时RT-PCR及Western blot分析技术,测定脂肪组织及非脂肪组织H6PDH表达水平;脂肪组织GCs途径(11β-HSD1,GR)、脂肪组织脂肪合成途径相关酶(ACC,ACL,FAS,PEPCK)、肥胖基因(C/EBPα,PPARγ,SREBP,Leptin)、内质网应激途径(IRE1α/XBP1)、Akt/GSK3β途径及脂肪组织褐色化基因(CD137,TBX1,GLUT4)表达的变化。2.脂肪H6PDH敲除在改善代谢表现型中的作用(1)脂肪组织H6PDH敲除小鼠模型建立:将表达H6PDH Floxed等位基因小鼠与脂肪细胞特异性Cre(adipQ-Cre)小鼠进行杂交,通过基因型筛选,获得 H6PDHAcKO 小鼠(Flox/Flox+Cre)。(2)利用H6PDHAcKO鼠进行孵育,通过基因型检测,确定脂肪组织H6PDH敲除鼠(H6PDHAcKO)及对照组(Flox)雄性小鼠。给予正常饮食喂养,并完成GTT及ITT测定,继续喂养至18周,将H6PDHAcKO鼠及对照组小鼠分别再分为两个亚组:禁食12小时或饱腹状态下处死,即空腹H6PDHAcKO组,饱腹H6PDHAcKO组,空腹对照组,饱腹对照组。收集血样、脂肪组织及非脂肪组织标本。1)记录小鼠体重、血压、脂肪重量、糖耐量及胰岛素敏感性的改变。2)测定血浆胰岛素、皮质酮、空腹及饱腹的游离脂肪酸水平。3)应用HE染色测定脂肪细胞大小。4)测定脂肪组织皮质酮水平、H6PDH及11β-HSD1的酶活性。5)应用实时RT-PCR及Western blot分析技术,测定脂肪组织及非脂肪组织中H6PDH的表达;脂肪组织中11β-HSD1、脂肪合成酶(ACC,ACL)及脂肪分解酶(HSL、ATGL)的表达。结果:1.脂肪H6PDH过表达在诱发腹部肥胖及胰岛素抵抗中的作用及分子机制(1)aP2-H6PDH小鼠增加了腹部脂肪堆积,同时上调了脂质合成酶(ACC,ACL)基因表达及其转录调节因子C/EBPα和PPARγ mRNA表达。(2)高脂饮食喂养时,aP2-H6PDH小鼠表现为明显的腹部脂肪聚积,同时活化GSK3β、诱导了 IRE1α/XBP1途径,但降低了 pThr308Akt/PKB含量及腹部脂肪褐色化基因CD137及GLUT4 mRNA表达。(3)aP2-H6PDH小鼠表现出糖耐量和胰岛素敏感性受损,且进一步加重了高脂饮食诱发的胰岛素抵抗。(4)高脂饮食喂养时,aP2-H6PDH小鼠升高了脂肪组织11β-HSD1表达及皮质酮的生成,而没有影响血浆皮质酮的水平。2.脂肪H6PDH敲除在改善代谢表现型中的作用(1)脂肪组织H6PDH敲除(H6PDHAcKO)小鼠脂肪组织H6PDH mRNA、蛋白表达及活性均显著降低,而非脂肪组织中H6PDH mRNA表达水平没有改变。(2)H6PDHAcKO小鼠脂肪重量较对照组降低,尤其是肠系膜脂肪,同时降低了脂质合成酶(ACC、ACL)基因表达及其转录调节因子C/EBPα mRNA表达。(3)H6PDHAcKO小鼠降低了脂肪组织中脂肪分解酶(HSL,ATGL)基因表达及血浆游离脂肪酸(FFA)水平。(4)H6PDHAcKO小鼠降低了空腹血糖,改善了糖耐量和胰岛素敏感性。(5)H6PDHAcKO小鼠脂肪组织11β-HSD1表达及活性的降低,同时降低了脂肪皮质酮水平,而没有改变血浆皮质酮的水平。结论:(1)脂肪组织H6PDH过表达及敲除小鼠可作为研究人类代谢综合征的较理想动物模型。(2)脂肪H6PDH通过调节11β-HSD1表达及其活化局部GCs的生成,引起脂肪代谢相关表现型的改变。(3)激活转录因子CEBPα、PPARγ,诱导内质网应激,活化Akt/GSK3β通路及减低白色脂肪褐色化是脂肪H6PDH过表达诱发的腹部脂肪堆积的主要发生机制。(4)脂肪H6PDH过表达降低了小鼠糖耐量及胰岛素敏感性,并进一步加重了高脂饮食诱发的腹部肥胖及胰岛素抵抗;相反,脂肪组织H6PDH敲除则可抑制脂肪合成、改善脂肪分布,同时也抑制脂肪分解代谢、改善胰岛素的敏感性。(5)脂肪组织H6PDH过表达及敲除小鼠改变了脂肪组织GCs水平,但没有影响血浆GCs水平。