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背景:生脉方由人参、麦冬、五味子三味药组成,其注射液临床上常用于低血压休克、病毒性心肌炎及心脑缺血性疾病的治疗。课题组前期研究显示,摄取转运体OATP1B1/1B3、NTCP均介导了生脉方复杂组分间的相互作用。乳腺癌耐药蛋白(BCRP)是一种重要的外排转运体,在体内药物处置过程中发挥了重要的作用。基于BCRP介导的植物药与化学药物间的相互作用及其不良反应已引起广大学者的关注。BCRP是否参与生脉方复杂组分的体内转运过程,不同组分间是否产生基于BCRP介导的相互作用与配伍机理,亦值得我们深入研究与探讨。目的:采用稳定表达BCRP的LLC-PK1细胞模型及囊泡模型,研究生脉方主要效应组分对BCRP转运功能的影响及其复杂组分间基于BCRP介导的相互作用与配伍机理,为生脉方临床合理应用提供实验依据,亦为中药现代化研究拓展新的思路。方法:1.建立快速灵敏的LC-MS检测方法,用于细胞及囊泡样品中甲氨蝶呤(MTX)、人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麦冬皂苷D、麦冬皂苷Dˊ、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子醇乙的浓度检测。2.利用稳定表达BCRP的LLC-PK1细胞模型,研究生脉方主要药效部位及效应成分在细胞中积聚与转运情况、对BCRP经典底物MTX转运的抑制情况、以及不同组分间基于细胞中BCRP介导的相互作用与配伍机制。3.利用稳定表达BCRP的囊泡模型,研究生脉方主要药效部位及效应成分在囊泡中的转运情况、对BCRP经典底物荧光黄转运的抑制情况、以及不同组分间基于囊泡中BCRP介导的相互作用与配伍机制。结果:1.本实验所建立的MTX、人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re、麦冬皂苷D、麦冬皂苷Dˊ、甲基麦冬二氢高异黄酮A、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲和五味子醇乙的LC-MS定量分析方法特异性、精密度和准确度均较好,能满足定量分析要求。2.在BCRP细胞模型中,生脉方效应成分人参皂苷Re、Rg1、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素在LLC-PK1/BCRP中的积聚量明显低于LLC-PK1细胞,在加入抑制剂Ko143后积聚量有所增加;双向转运实验中,上述四种组分在LLC-PK1细胞的ER值均小于2,但在LLC-PK1/BCRP细胞的ER值均大于2,分别为2.23、2.54、4.10、5.51,且在加入Ko143后其ER值相应减小至1.67、1.43、2.01、2.70。在细胞积聚实验中,五味子醇乙(100μM)可使经典底物MTX在细胞内积聚增加2.13倍;双向转运实验中MTX的ER从7.89降到3.83。在细胞积聚实验中,五味子醇乙(100μM)也可以使甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素在细胞内积聚分别增加1.14倍和1.43倍,但对人参皂苷Re、Rg1的转运没有影响;在双向转运实验中,100μM五味子醇乙可使甲基麦冬二氢高异黄酮B的ER值从3.91降到2.97,五味子甲素的ER值从5.82降到4.02,但对BCRP转运人参皂苷Re、Rg1没有影响。3.在BCRP囊泡模型中,生脉方4种主要效应成分人参皂苷Re、Rg1、甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素摄取动力学参数Km(μM)分别为111.9±31.26、82.01±16.72、57.06±8.789和37.19±6.512,Vmax(pmol/mg protein/min)分别为39.37±5.197、40.84±3.467、131.2±8.692和168.3±10.82;且它们在BCRP囊泡中的摄取均可以被经典抑制剂Ko143明显抑制。经典底物荧光黄的酶动力学参数Km与Vmax分别为18.86±2.149μM和254.8±8.312 pmol/mg protein/min。生脉方主要效应部位人参总皂苷、五味子总木脂素对BCRP囊泡中荧光黄的摄取有明显的抑制作用,在100μM时其抑制率分别为89%、70%。效应组分中人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙对荧光黄的摄取有明显的抑制作用,在100μM时其抑制率分别为78%、59%和74%,其IC50值分别为20.46±1.47μM、42.02±2.31μM、27.13±5.49μM。人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙可通过非竞争性抑制模式来抑制荧光黄的摄取,其Vmax值分别从254.8±8.322pmol/mg protein/min减少至180±4.751pmol/mg protein/min、254.8±8.322pmol/mg protein/min减少至207.8±6.381pmol/mg protein/min、254.8±8.322pmol/mgprotein/min减少至202.3±4.232pmol/mg protein/min,而Km值几乎不变。此外,五味子总木脂素、人参皂苷Rd和五味子醇乙对人参皂苷Re在BCRP囊泡中的摄取有明显的抑制作用,在50μM时其抑制率分别为29%、21%和17%,人参皂苷Rb1对囊泡中人参皂苷Re的摄取无明显影响。五味子总木脂素、人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙对囊泡中人参皂苷Rg1的摄取有明显的抑制作用,在50μM时其抑制率分别为52%、30%、19%、和18%。人参总皂苷、五味子总木脂素、人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙对囊泡中甲基麦冬二氢高异黄酮B的摄取有明显的抑制作用,在50μM时其抑制率分别为71%、55%、31%、22%和26%。人参总皂苷、人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙对囊泡中五味子甲素的摄取有明显的抑制作用,在50μM时其抑制率分别为85%、54%、33%和32%。结论:1.在LLC-PK1/BCRP细胞模型中,人参皂苷Re、Rg1、甲基麦冬二氢高异黄酮B和五味子甲素为BCRP潜在的底物。五味子醇乙抑制BCRP介导的MTX转运,为BCRP潜在抑制剂,可能与临床药物间发生基于BCRP介导的相互作用。五味子醇乙对BCRP介导的甲基麦冬二氢高异黄酮B、五味子甲素转运有不同程度的抑制作用,但对人参皂苷Rg1、Re的转运没有影响。生脉方主要组分间存在基于BCRP介导的相互作用及配伍机制。2.在BCRP囊泡模型中,人参皂苷Re、Rg1、甲基麦冬二氢高异黄酮B和五味子甲素是BCRP潜在的底物。人参总皂苷、五味子总木脂素、人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙可不同程度地抑制BCRP介导的荧光黄转运,是BCRP潜在的抑制剂,可能与临床药物间发生基于BCRP介导的相互作用。人参总皂苷、五味子总木脂素、人参皂苷Rd、Rb1和五味子醇乙对BCRP介导的人参皂苷Rg1、Re、甲基麦冬二氢高异黄酮B和五味子甲素的转运均有不同程度的抑制作用。生脉方主要组分间存在基于BCRP介导的相互作用及配伍机制。