【摘 要】
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植物在生长发育过程中经常受到不良环境的影响。为了生存和适应环境,植物进化出多种应答逆境胁迫的信号转导途径和复杂的生理生化机制。HD-ZIP是植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育和胁迫应答过程。以往有许多关于HD-ZIP家族基因影响叶片发育、开花时间、不定根生长、茎的伸长和分蘖等方面的研究,而有关杨树HD-ZIP家族基因抗旱耐盐功能的研究却鲜有报道。本研究以小黑杨（Populus simonii
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572018CL03）；
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植物在生长发育过程中经常受到不良环境的影响。为了生存和适应环境,植物进化出多种应答逆境胁迫的信号转导途径和复杂的生理生化机制。HD-ZIP是植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育和胁迫应答过程。以往有许多关于HD-ZIP家族基因影响叶片发育、开花时间、不定根生长、茎的伸长和分蘖等方面的研究,而有关杨树HD-ZIP家族基因抗旱耐盐功能的研究却鲜有报道。本研究以小黑杨（Populus simonii×Populus nigra）为研究对象,分析杨树HD-ZIP家族基因应答盐胁迫情况,筛选出一个明显应答盐胁迫的PsnHDZ01基因,解析其在高盐和干旱胁迫中的应答机制,结果如下:（1）从杨树基因组中鉴定出63个HD-ZIP家族成员,随机分布在19条染色体上,均具有保守的Homeobox和HALZ结构域。基于基因结构和系统进化关系,杨树HD-ZIP家族成员可分为4个亚家族,它们具有丰富的节段性复制事件且经历了很强的纯化选择,同时也拥有多样的共线性进化关系。通过转录组测序,从HD-ZIP家族基因中鉴定出40个应答盐胁迫的差异表达基因,其中PsnHDZ01在根茎叶中均显著上调表达。（2）亚细胞定位分析显示PsnHDZ01蛋白定位于细胞核。PsnHDZ01基因表达具有组织特异性,主要在茎部表达。时空表达模式分析发现,PsnHDZ01可以在小黑杨不同组织中被盐、旱、ABA和Me JA诱导表达,且在24 h达到峰值。酵母单杂交证明,PsnHDZ01可以与抗逆顺式作用元件TA1（TAATTA）、TA2（AATATTATT）、HBS1（AAGAAG）、Myb-P2（CCTACC）、DRE1（ACCGAC）和ERD（TGTCA）特异性结合。（3）克隆PsnHDZ01启动子,通过农杆菌介导法获得转基因小黑杨植株,GUS染色结果表明该启动子具有转录活性。PsnHDZ01启动子包含许多与生长发育、非生物胁迫和次生代谢物合成相关的元件。利用酵母单杂交鉴定出2个可与PsnHDZ01启动子特异性结合的抗逆相关蛋白PsnHDZ06和Psn ABF3,其作为上游调控因子调节PsnHDZ01基因表达水平。（4）通过农杆菌介导法获得PsnHDZ01过表达和RNAi抑制表达转基因小黑杨植株。在盐胁迫条件下,过表达转基因植株比野生型表现出明显的生长优势,而抑制表达转基因植株比野生型表现出明显的生长劣势;过表达PsnHDZ01转基因杨树的POD和SOD活性明显提高,叶绿素和脯氨酸含量明显增加,H2O2、MDA含量、电导率和失水率明显降低。（5）通过转录组测序,从过表达PsnHDZ01转基因小黑杨中鉴定出464个差异表达基因,其中335个为上调基因,129个为下调基因;通过GO分类分析发现,这些差异表达基因主要参与代谢、生物和应激反应等生物学过程。酵母单杂交、双荧光素酶活性验证和Ch IP实验结果均证明PsnHDZ01可以与下游基因Psn WRKY51、Psn SRK2C和Psn WRKY70的启动子结合,调控这些基因的表达水平。（6）自激活实验表明PsnHDZ01具有自激活活性,自激活区域位于C端。通过酵母双杂交从杨树c DNA文库中筛选出8个与PsnHDZ01蛋白互作的蛋白。酵母双杂交回转和Bi FC验证表明PsnHDZ01可以和PsnHMP20、PsnHDZ13、PsnHDZ50及其自身互作形成二聚体。通过农杆菌介导法获得PsnHDZ50过表达和RNAi抑制表达转基因小黑杨株系。在盐胁迫条件下,PsnHDZ50转基因杨树和PsnHDZ01转基因杨树的表型和生理指标均呈现出类似的特征,说明PsnHDZ50与PsnHDZ01之间具有协同互作关系。综上所述,本研究从杨树HD-ZIP家族中鉴定出一个重要的抗逆基因PsnHDZ01,初步明确了该基因的抗逆机制和信号转导途径,为完善杨树复杂的胁迫应答网络提供线索,为今后杨树抗逆育种提供重要的理论支持和基因资源。
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