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目的:研究沉默磷脂酶Cε(PLCε)对膀胱癌T24细胞基因表达谱的影响并筛选与损伤修复信号通路相关的差异基因。探讨沉默PLCε对膀胱癌细胞顺铂敏感性的影响及分子机制。寻找调控PLCε的miRNA并进一步探讨其对膀胱癌顺铂敏感性的影响和相关分子机制。方法:(1)利用PLCε的干扰腺病毒感染膀胱癌T24细胞沉默PLCε的表达,分别提取PLCε沉默组及其对照组总的RNA,利用Agilent4×44K全基因组芯片进行检测并筛选出差异基因。首先对差异基因进行KEGG-pathway分析筛选相关性较强且感兴趣的信号通路,然后对相应信号通路中的差异基因进行GO及Heatmap分析,最终筛选出几个目标差异基因,采用qRT-PCR和western blot检测目标差异基因对基因芯片结果进行验证,免疫组化进一步分析PLCε与目标差异基因EXO1在膀胱癌组织中的表达。(2)利用q-PCR和western blot检测膀胱癌细胞和小鼠膀胱移行上皮细胞中PLCε及EXO1的表达。沉默PLCε后顺铂处理膀胱癌细胞,MTT检测膀胱癌细胞对顺铂敏感性的影响,进一步采用FCM检测细胞的凋亡情况以及细胞周期变化情况;为探究其机制,PLCε干扰腺病毒组、顺铂组及二者联用组后分别处理膀胱癌细胞,western blot检测以上各组ATM的磷酸化情况及EXO1和γH2AX的表达,atm特异性抑制剂ku-55933处理细胞后,westernblot检测上述分子的表达。if检测各处理组细胞中p-atm在胞核和胞浆的分布情况,提取核浆蛋白westernblot分别在胞核和胞浆中检测p-atm的表达。(3)利用生物信息学网站预测调控plcε的mirna,结合文献中膀胱癌microrna表达谱芯片结果,筛选出mir-145。在膀胱癌细胞中转染mir-145mimics,q-pcr、westernblot检测plcε的表达,荧光素酶报告实验验证mir-145与plcε靶向作用关系。收集70例血清标本(40例bca患者,15例膀胱结石及膀胱炎患者,15例健康体检者),采用qpcr检测血清中mir-145的表达情况并分析其表达与临床各病理参数的相关性。为进一步研究mir-145对膀胱癌顺铂敏感性的影响,mtt检测细胞的增殖活性,westernblot检测相关蛋白表达。结果:(1)沉默plcε将引起t24细胞基因表达谱发生广泛的变化,差异倍数在2倍以上的基因共3983个,沉默plcε后上调的基因有1728个,下调的基因有2255个;kegg-pathway富集分析结果(pvalue<0.05)显示plcε主要参与p53、错配修复、同源重组、色氨酸代谢、丙氨酸和天冬氨酸代谢、碱基切除修复等信号通路的调控。依据信号通路相关性分析选择dna损伤修复信号通路中的基因exo1、lig1、pold1和rad51作为目标差异基因在膀胱癌细胞中进行验证,rt-pcr结果显示沉默plcε后4个差异基因的表达均下调(p<0.05),与芯片数据结果一致。最终选择差异最为明显的exo1进行后面的研究,ihc结果发现plcε和exo1在膀胱癌组织中的表达均明显高于(p<0.05)癌旁组织。因此我们设想plcε参与的dna损伤修复信号通路可能与膀胱癌细胞对顺铂的敏感性相关。(2)q-pcr和westernblot结果显示膀胱癌t24、biu-87细胞中plcε的表达明显高于(p<0.05)小鼠正常膀胱移行上皮细胞,且biu-87细胞中plcε的表达较t24表达增高(p<0.05);顺铂处理上述三种细胞,mtt检测细胞的增殖活性结果发现小鼠膀胱移行上皮细胞较膀胱癌细胞对顺铂更敏感(p<0.05),且t24细胞较biu-87对顺铂更敏感(p<0.05)。沉默t24、biu-87细胞中plcε的表达,mtt结果显示膀胱癌细胞对顺铂的敏感性增加(p<0.05),fcm结果进一步表明,沉默plcε后将增加顺铂诱导的膀胱癌细胞凋亡,并能加强顺铂引起的s期阻滞(p<0.05)。westernblot结果表明,沉默plcε后,t24和biu-87细胞中p-atm、exo1和γh2ax的表达降低(p<0.05),顺铂处理后细胞中p-atm、exo1和γh2ax表达增高(p<0.05),二者联用后上述分子表达明显降低(p<0.05),且plcε干扰腺病毒与ku-55933联用后细胞中p-atm的表达较二者单独处理组均降低(p<0.05)。if结果表明沉默plcε后可以明显减少顺铂引起的p-atm入核(p<0.05)。(3)q-pcr、westernblot及双荧光素酶报告实验表明plcε是mir-145的靶基因。q-pcr分析血清中mir-145的表达情况,结果表明mir-145在膀胱癌病人血清中低表达(p<0.05),在正常人及膀胱结石病人血清中均呈高表达(p<0.05);mtt及westernblot结果表明,在t24和biu-87中转染mir-145mimics后可以显著增加对膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。结论:plcε与膀胱癌细胞中dna损伤修复相关基因的表达有关,沉默plcε可以通过atm/exo1信号通路提高膀胱癌细胞对顺铂的敏感性,过表达miR-145可以通过靶向抑制PLCε及下游信号通路而增加膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。