日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)属于黄病毒科,感染后可损害人中枢神经系统或引起猪死胎、木乃伊胎等繁殖机能障碍。因为没有对其有效的治疗方法,接种疫苗是最有效的预防该病的方法。目前主要通过弱毒疫苗和灭活疫苗防止乙脑病毒感染和流行。干扰素刺激基因15是一种泛素样蛋白,由IFN-α/β刺激产生,具有抗病毒作用,已有很多研究证实其在体内外的抗病毒作用。ISG15可能作为潜在的免疫佐剂增强疫苗的免疫效果。目前还有很多新型化学合成类佐剂可以刺激先天性免疫和适应性免疫应答,成为研究热点并应用于人用疫苗。本研究证实了 ISG15的体外抗病毒效应,探究了三种免疫增强剂对JEV灭活疫苗免疫效果的影响,以及对体内ISG15表达的影响。1.建立 JEV、ISG15、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和 β-actin基因 RealTimePCR检测方法本研究根据GenBank中JEV核酸序列和猪源ISG15、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和β-actin mRNA核酸序列设计Real Time PCR引物。JEV病毒以感染复数M.O.I.=1接种猪外周血淋巴细胞,24 h后提取细胞RNA并反转录为cDNA,同时构建JEV PreM基因阳性标准质粒,以此为模板,建立Real Time PCR反应,确定退火温度和引物浓度,建立JEV、ISG15、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和β-actin基因的标准曲线。确定退火温度为60℃,引物浓度为0.25 μM。以此建立的Real Time PCR反应标准曲线各参数均符合要求,判定系数R2均大于0.99,JEV、β-actin、ISG15、IFN-γ、IL-2、IL-4 和 IL-10 扩增效率分别为 103.0%、103.0%、107.3%、97.3%、96.9%、100.4%、103.1%。该方法的重复性和特异性较好,为后续试验打下基础。2.过表达和干扰ISG15对JEV体外增殖的影响本研究通过IFN-α和JEV刺激猪睾丸(ST)细胞,实时荧光定量PCR检测干扰素刺激基因-15(ISG15)表达情况和JEV病毒核酸拷贝数,结果表明ISG15 mRNA相对表达量显著上升,JEV核酸拷贝数下降。扩增ISG15基因,克隆至pcDNA3.1表达载体,构建ISG15真核表达质粒。将此质粒转染ST细胞,24h后接种JEV。经检测,转染后ISG15mRNA表达量显著上升,病毒核酸量和滴度下降,表明ISG15过表达可显著抑制JEV体外增殖。构建ISG15靶向干扰质粒,转染ST细胞,24h后接种JEV,转染后ST细胞ISG15 mRNA相对表达量下降,成功干扰ISG15的表达,JEV病毒核酸量和滴度上升。以上结果提示ISG15对JEV体外增殖有抑制作用。3.三种免疫佐剂对仔猪JEV灭活疫苗免疫效果的影响和ISG15的mRNA相对表达量变化本研究首先增殖JEV JS01病毒株,病毒滴度为107.5TCID50/mL,甲醛灭活病毒,制备常规白油乳剂JEV灭活疫苗和分别添加IP-23、IP-24、IP-26免疫增强剂的白油乳剂灭活疫苗。40日龄乙型脑炎抗体呈阴性的健康仔猪25头,随机分成5组,每组5头。第1、2、3组分别为含有IP-23、IP-24、IP-26免疫增强剂的JEV灭活疫苗试验组,第4组为常规灭活疫苗组,第5组为注射PBS空白对照组。间隔两周加强免疫一次。免疫增强剂试验组与常规免疫组相比,仔猪血清中和抗体滴度提高,其中IP-24组最显著。加免后14、28天分离外周血淋巴细胞。MTT法检测淋巴细胞增殖水平无显著差异。PBMCs用JEV JS01刺激24 h后收集细胞,Real Time PCR检测外周血淋巴细胞中细胞因子表达水平,其中ISG15 mRNA表达水平无显著差异。IP-24和IP-26组的IFN-γ、IL-2表达量显著上升,对Th1型免疫有促进作用。IP-23免疫组的IL-4表达量显著上升,主要促进Th2型免疫应答。