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肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)能够感染人和动物,是常见的人畜共患病原体。由SPI-1和SPI-2编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是沙门氏菌致病重要的毒力因子,不同T3SS的效应蛋白在细菌致病的各个阶段发挥不同的作用。目前对这些效应蛋白的研究主要是以鼠伤寒沙门氏菌为模型的,但它们在不同血清型沙门氏菌中的功能可能不一致。本研究选取了在肠炎沙门氏菌T3SS的6个效应蛋白基因,采用λRed同源重组法构建相应的缺失株,初步探讨了这些效应蛋白与致病性的关系,为进一步深入研究肠炎沙门氏菌感染过程中T3SS效应蛋白的分子机制奠定了基础。1.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备通过PCR扩增效应蛋白SspH2、SlrP、SseL的完整基因序列,分别克隆至两种不同的原核表达载体pET-32a(+)和pGEX-6p-1,构建pET-32a-SspH2、pET-32a-SlrP和pET-32a-SseL以及pGEX-6p-1-SspH2、pGEX-6p-1-SlrP和pGEX-6p-1-SseL的重组质粒,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE的结果分析,这六种重组蛋白均能够表达,并且蛋白大小与预期一致。可溶性分析结果显示,六种融合蛋白部分存在于细菌的裂解上清中。将纯化后的GST融合蛋白免疫家兔,以His标签融合蛋白为抗原的间接ELISA法检测免疫后的效价情况,结果显示三免14天后获得了针对SspH2、SlrP、SseL蛋白的高效价抗血清。2.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白相关基因缺失株的构建以一株肠炎沙门氏菌C50041为母本,采用Red同源重组法构建SspH2、PipB、SseL、 SopE2、SlrP和SipB这6个基因的缺失突变株,PCR扩增以及突变株序列测序结果证明了这6个基因突变株的构建成功。使用第一章中制备的SspH2、SlrP和SseL融合蛋白的抗血清作为一抗,通过Western-blot的方法对缺失株的这三种蛋白的表达情况进行检测,结果显示△SspH2.△SseL和△SlrP检测不到相应的效应蛋白,其它基因的缺失对这三种蛋白的表达不产生影响。细菌的生长曲线和血清杀菌结果显示,这些效应蛋白基因的缺失对细菌的生长速度无明显影响,细菌的表面结构和渗透性也未发生明显的改变。3.肠炎沙门氏菌T3SS效应蛋白的致病作用对野生株C50041和△SopE2、△SipB、△PipB、△SseL、△SspH2、△SlrP缺失株进行HeLa细胞的黏附和侵入试验以及HD11巨噬细胞内增殖试验。结果显示,与野生株和其它基因缺失株相比,△SipB缺失株的黏附和侵入能力出现了较为显著的下降,而SseL基因的缺失,使得C50041对HeLa细胞的黏附和侵入能力得以增强。巨噬细胞内增殖试验中,各组细菌的增殖率无明显变化。细菌侵入HeLa细胞后不同时间点细胞因子表达水平的结果显示,IFN-γ、TNF-α以及IL-18的表达水平差异不明显,而△SspH2在侵入HeLa细胞6h时,IL-8的表达水平显著高于野生株；△PipB在侵入HeLa细胞6h时,IL-1p的表达水平显著高于野生株C50041。1日龄雏鸡致死性试验结果显示,缺失株△SipB.△SseL和△SlrP的LDso均高于野生株C50041,其中△SipB缺失株的毒力下降最为明显；而缺失株△PipB.△SopE2和△SspH2的LDso均低于野生株C50041,特别是△SspH2缺失株的毒力增强最明显。本文成功构建了肠炎沙门氏菌6个效应蛋白基因的缺失株,缺失效应蛋白SipB和SlrP可降低其毒力,缺失效应蛋白SspH2和PipB可增强其毒力,而缺失效应蛋白SseL和SopE2对其毒力无显著影响,PipB、SspH2、SseL和SopE2与已报道的在鼠伤寒沙门菌中的作用存在一定的差异。