论文部分内容阅读
作为微RNA病毒5’非编码区(5’UTR)的重要顺式作用元件,内部核糖体进入位点(IRES)结合多种宿主蛋白参与病毒的复制过程中。本实验室前期研究发现口蹄疫病毒(FMDV)IRES结构域4上的C351G突变,能够导致FMDV温度敏感减毒株的产生,然而其温度敏感性减毒的分子机制尚不明确。在本研究中,通过IRES结构分析,我们发现C351G所在的茎-环结构是细胞多聚嘧啶结合蛋白(PTB,也称为hnRNP1)与IRES相互作用的区域之一,而PTB是IRES介导的翻译起始过程中的关键宿主因子。因此,我们推测C351G突变可能改变了 IRES与PTB蛋白的结合,从而决定FMDV的温度敏感减毒表型。通过RNA pulldown和亲和力试验,我们发现C351G突变引起PTB与FMDV IRES结合发生温度依赖性减弱,进而引起IRES温度依赖性翻译缺陷,是导致FMDV温度敏感性减毒的分子基础。PTB蛋白,也称为核不均一核糖核蛋白Ⅰ(hnRNPⅠ),是核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)的重要成员。然而,除了 PTB蛋白,还有哪些关键宿主蛋白参与并调控FMDV的复制,信息有限。因此,为了筛选与FMDV IRES相互作用的宿主细胞蛋白,我们以生物素标记的IRES RNA为“诱饵”,通过RNA pulldown技术从FMDV易感的BHK-21细胞中筛选并获得与其相互作用的宿主蛋白。差异性蛋白条带的质谱分析显示,至少存在核不均一核糖核蛋白L(hnRNP L)等8种与FMDV基因组IRES相互作用的宿主蛋白。hnRNPL也是hnRNPs蛋白家族的重要成员,参与细胞中mRNA代谢的调控。首先,利用竞争试验和激光共聚焦等试验,我们验证了 hnRNP L与FMDV IRES的特异性相互作用。并进一步通过截短试验,发现hnRNP L通过结构域RRM3-4与FMDV IRES Domain 4-5结合。这种蛋白-RNA相互作用导致FMDV在细胞中的复制明显受到抑制。然而令人惊奇的是,hnRNP L对FMDV生长的抑制作用虽然以结合IRES为前提,可是与IRES介导的翻译功能无关。由此推测,IRES的结合只是为hnRNP L提供一个空间位点,使之有机会与其他宿主细胞或病毒的因子互作以阻止病毒RNA的合成。接下来的研究发现,在感染细胞中hnRNP L阻止FMDV RNA的合成、由此抑制FMDV的复制。已知PTB蛋白可稳定IRES结构、对于FMDV复制是需要的,这使人联想到hnRNP L可能通过与PTB互作影响PTB的稳定功能、导致IRES已被降解而抑制FMDV的复制,但研究结果表明hnRNPL不影响IRES的稳定性。进一步的研究表明,在感染细胞内hnRNPL与病毒聚合酶3Dpol相互作用,而且这种互作是FMDVRNA依赖性的,提示hnRNPL存在于RNA复制复合物中发挥抑制功能,但其作用机制尚不清楚。考虑到hnRNP L通过其RNA结合域RRM3-4与FMDV IRES的结构域Domain 4-5互作,而且有研究表明hnRNP L的RRM3-4通过结合RNA的不同位点使之环化,因此我们推测,hnRNP L可能通过结合IRES使之改变构象,从而招募其他蛋白或非编码RNA来影响复制复合物中病毒RNA的合成。综上所述,本研究发现了 FMDVIRES C351G突变使IRES与细胞hnRNPⅠ(PTB)蛋白的结合呈现温度依赖性减弱,导致温度依赖性IRES翻译起始缺陷是决定FMDV的温度敏感性及其减毒表型的分子基础。同时,我们发现一个新的FMDV复制抑制因子—hnRNP L,它通过阻止FMDV RNA的合成抑制FMDV的复制。这两个核不均一核糖核蛋白家族的关键成员(hnRNPⅠ和hnRNP L)的研究加深了我们对IRES在参与FMDV复制及其致病过程中的理解,有助于深入研究究FMDV毒力及宿主嗜性改变的分子机制。