新型能源的开发和利用是人类面对化石能源紧缺、环境污染及粮食供给等问题所采取的重要措施,对社会可持续发展具有重大的意义。燃料乙醇是公认的很有发展前景的可再生新型生物能源。在发展过程中,由于第一代燃料乙醇的生产以粮食为原料,存在与人争粮、与粮争地的问题,后续人们提出以地球上最丰富的、廉价的可再生生物质资源木质纤维素材料为原料的第二代燃料乙醇生产模式,以期实现燃料乙醇的大规模应用,达到缓解能源危机等问题的目的。木质纤维素材料水解后可释放大量单糖,除了葡萄糖外,还有含量可观的木糖和L-阿拉伯糖等戊糖。实现木质纤维素材料水解液全糖组份的共利用是纤维素乙醇生产上经济可行的关键,也是需要解决的主要技术瓶颈之一。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统的乙醇生产菌株,也是第二代燃料乙醇生产中使用的重要工程菌株。天然的酿酒酵母具有优良的葡萄糖发酵能力,但不能有效地利用戊糖。酿酒酵母戊糖代谢工程的研究已开展多年,虽然已经使酿酒酵母能够利用这两种戊糖(木糖和L-阿拉伯糖),且通过多角度改造,糖醇转化效率也有所提高,但依然存在一些瓶颈,影响了戊糖的利用效率。其中,戊糖转运环节被认为是现阶段酿酒酵母代谢工程戊糖利用的主要限速步骤之一。天然的酿酒酵母可以通过自身的已糖转运蛋白转运戊糖,对木糖和L-阿拉伯糖转运能力较高的转运蛋白是Gal2p,但整体转运效率不足并且受到葡萄糖的强烈抑制,影响戊糖的利用。筛选或(并)改造异源戊糖转运蛋白以期解除或缓解葡萄糖抑制是提高酿酒酵母戊糖转运效率的有效策略,同时也可以丰富人们对糖转运机理的认知,相关研究已成为这一领域新的研究热点。缺乏有效简便的糖转运蛋白活性变化的高通量筛选方法,天然转运蛋白对戊糖的转运效率与专一性存在一定的矛盾,以及转运蛋白对戊糖转运往往受到葡萄糖强烈抑制的机制,是亟待解决的科学问题。目前为止,缺乏在酿酒酵母木糖代谢菌株中有效缓解葡萄糖抑制的高效专一性戊糖转运蛋白。同时,对酿酒酵母L-阿拉伯糖代谢工程而言,其研究起步较晚于木糖代谢工程,转化乙醇的效率也远远低于木糖底物,其中除了转运蛋白的影响以外,更为基本的点是各代谢节点的影响。为此,本论文主要开展了以下研究：1、木糖转运蛋白高通量筛选方法的建立通过直观的显色变化在酿酒酵母中构建了基于木糖类似物pNPX的木糖转运蛋白高通量筛选方法。具体原理是：木糖类似物pNPX通过转运蛋白穿过细胞膜,在胞内被高酶活表达的木糖苷酶水解释放可以自由出胞的发光基团pNP,在胞外碱性条件下显示出黄色,根据显色强弱,间接定量判断由pNPX表征的木糖转运能力。从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中克隆得到木糖苷酶XynB,可以水解木糖类似物pNPX释放发光基团pNP,在酿酒酵母中以29.34±2.87 U(g DCW)-1的胞内酶活高水平表达,胞外未检测出酶活。完整细胞测定时的XynB酶活为0.21±0.01U(gDCW)-1,远小于胞内酶活,酶解过程不是限速步骤；95%以上的pNP存在于胞外,pNP的出胞环节亦不是限速步骤。完整细胞酶活测定时,只有pNPX的转运环节是限速步骤。进一步测定了pNPX和木糖之间存在竞争抑制关系,在酿酒酵母中构建了使用木糖类似物pNPX来检测木糖转运蛋白转运活性的高通量筛选方法。2、应用木糖转运蛋白高通量筛选方法研究AraEp的转运功能区域应用木糖转运蛋白的高通量筛选方法,分析得到细菌源木糖转运蛋白AraEp的TMS 5是木糖转运功能区域。在酿酒酵母中高表达了来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的木糖转运蛋白AraEp后,菌株的pNPX转运活性提高了184%。通过易错PCR的方法构建AraEp突变体库,应用构建的方法在96孔平板上高通量筛选,从约5000个转化子中获得了6个转运活性显著提高的突变子,提高幅度在15.8%至103%,序列分析后发现第五跨膜区(TMS 5)两个位点的突变(1178S和V179D)可以显著提高AraEp的转运能力,此跨膜区域是AraEp的转运功能区域之一。3、葡萄糖和戊糖同步利用供体菌中戊糖转运蛋白的克隆葡萄糖和戊糖同步利用供体菌中克隆得到6个戊糖转运蛋白基因。通过葡萄糖和戊糖等浓度共培养方式,验证了供体菌利用葡萄糖和戊糖不存在明显的竞争抑制。通过保守区域扩增、染色体步移技术和外显子预测的策略从供体菌皮状丝孢酵母2.571(Trichosporon cutaneum,2.571)中获得2个转运蛋白基因序列Tctl和Tct2。以酿酒酵母内源的戊糖转运蛋白Ga12p为分子探针,从供体菌季也蒙酵母(Meyerozyma guilliermondii)基因组数据库中筛选并克隆得到了4个转运蛋白Mgt04891p、Mgt05196p、Mgt05293p和Mgt05860p。6个转运蛋白与Ga12p的氨基酸序列相似性为47%-77%;氨基酸序列进化树分析显示,克隆得到的这些转运蛋白具有广泛的代表性。4、异源戊糖转运蛋白的功能分析通过戊糖胞内积累量测定、已糖梯度平板生长、木糖转运过程中胞外pH变化、木糖生长能力、高密度菌株木糖代谢、木糖转运偏好性研究等策略,筛选出高效率的木糖转运蛋白Mgt05196p。将所研究的异源转运蛋白表达在酿酒酵母已糖转运蛋白全敲除菌株EBY.VW4000中进行转运功能分析。通过测定胞内木糖和L-阿拉伯糖积累量的方式测定了木糖和L-阿拉伯糖的转运能力。分析得到Tctlp为L-阿拉伯糖转运蛋白,其表达菌株的胞内L-阿拉伯糖净积累量为Ga12p表达菌株的22%；Tct2p可以同时低效率转运木糖和L-阿拉伯糖两种戊糖。Mguilliermondii源的4个转运蛋白均是木糖转运蛋白。Mgt04891p和Mgt05860p为质子同向协同型木糖转运蛋白,Mgt05860p表达菌株的净木糖积累量最高,相比于Ga12p表达菌株提高了116%。Mgt05196p和Mgt05293p为单向异化扩散型木糖转运蛋白,Mgt05196p表达菌株的净木糖积累量相比于Ga12p表达菌株提高了13%。其中,Mgt04891p、Mgt05293p和Mgt05860p也能表现出明显的L-阿拉伯糖转运能力,Mgt05860p表达菌株的L-阿拉伯糖净积累量最高,比Ga12p表达菌株提高了93%。另外,C. glutamicum来源的AraEp只表现出一定的木糖转运功能。本文也研究了从瑞氏木霉(Trichoderma reesei)中克隆得到的戊糖转运蛋白Stplp,对木糖和L-阿拉伯糖都具有较显著的转运能力,其表达菌株的胞内木糖和L-阿拉伯糖净积累量分别为Ga12p表达菌株的56%和12%。已糖梯度平板生长测试显示,较高效率的木糖转运蛋白均可以转运已糖,未分析出戊糖转运专一性；戊糖转运蛋白的转运效率和专一性在一定程度上存在矛盾。在所研究的异源木糖转运蛋白中,Mgt05196p使表达木糖XR-XDH途径的EBY.VW4000菌株在以木糖为唯一碳源培养基上的生长和代谢能力最高,接近Ga12p表达菌株；并且与Ga12p相比,木糖转运偏好性(葡萄糖和木糖等浓度共存条件下)提高了50%。5、Mgt05196p的糖转运活性位点分析使用规模化定点突变策略分析出Mgt05196p的糖专一性转运活性位点。以大肠杆菌木糖转运蛋白XylEp的晶体结构为模板,对Mgt05196p进行同源模建和木糖分子对接,预测木糖转运的功能位点；同时,通过与目前已报道的转运蛋白的葡萄糖或木糖转运功能性位点进行氨基酸序列比对,选择Mgt05196p上保守的氨基酸位点；借助以上两种方式共筛选得到了Mgt05196p中的28个潜在的糖转运功能位点。将预测的氨基酸位点突变成非极性的丙氨酸(A),表达在含有木糖途径XR-XDH的EBY.VW4000中,通过测定比生长速率值来分析突变子对木糖和葡萄糖的转运能力,同时进一步通过测定胞内木糖积累量的方法测定木糖转运能力。位点D72、R164和Y336的突变,使表达菌株同时丧失了对木糖和葡萄糖的转运能力；F333的突变使菌株丧失了木糖转运能力。1202、Q326、 N331、Y332、F334和Y335的突变,对菌株的木糖转运能力也产生显著负影响,使木糖上的比生长速率分别降低了48%、69%、90%、84%、72%和79%,胞内净木糖积累量分别降低了54%、54%、88%、67%、64%和59%。F69、F333和F334的突变可以显著降低葡萄糖上的比生长速率,分别降低了69%、92%和52%。Q199、N360和F432的突变在一定程度上增强了表达菌株的木糖生长能力；孵育120 min时,F432A突变子表达菌株的胞内净木糖积累量也提高了14%。N360进一步突变成丝氨酸(S)后,表达菌株在木糖上的比生长速率和胞内净积累量分别提高了32%和10%。N360突变成苯丙氨酸(F)后,转运蛋白丧失了葡萄糖转运能力,仍保留较高活性的木糖转运活性,并且有效缓解了葡萄糖对木糖的转运抑制。另外,存在于TMS7保守序列中的芳香族氨基酸富集区域YFFYY中每个氨基酸位点突变成丙氨酸均对表达菌株在木糖上的生长能力和胞内净积累能力产生显著的负影响,此区域对Mgt05196p的木糖转运能力发挥重要作用。本论文克隆得到的Mgt05196p高效率异源木糖转运蛋白可以促进酿酒酵母菌株对木糖的转运能力,具有一定的应用价值；缓解了葡萄糖抑制的木糖转运偏好性突变子Mgt05196p(N360F)在构建可以实现葡萄糖和木糖同步共糖利用的工程菌中具有重要意义。Mgt05196p木糖转运关键位点的分析对木糖转运机制的阐明也具有推动作用,为改造获得具有更高转运效能的木糖转运蛋白突变子的研究也起到了指导意义。6、L-阿拉伯糖代谢途径的构建与优化通过超表达araA基因、强化PPP途径中四个关键基因和转运蛋白Ga12p,并结合适应性进化策略获得了一株高效率代谢L-阿拉伯糖生产乙醇的酿酒酵母菌株。L-阿拉伯糖在木质纤维素单糖组份中的含量仅次于木糖,也是木质纤维素材料水解液全糖利用时不可或缺的一种戊糖。研究中以酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A为研究背景菌株,整合表达了含有植物乳杆菌来源的L-阿拉伯糖初始代谢途径三个基因araA、araB和araD的质粒YIp5-ara,但得到的重组菌株并没有获得利用L-阿拉伯糖的能力。进一步用附加体质粒和强启动子TEFlp局表达araA基因(表达量提高了32.5±0.7倍),经过150个小时的孵育,重组菌株出现了利用L-阿拉伯糖单糖为碳源生长的迹象。一定程度高水平表达的araA基因是使得此外源途径得以畅通的关键因素。进一步超表达下游PPP途径中的四个关键基因TALI、TKL1、RPE1和RKI1,并结合适应性进化的方法优化菌株,菌株的L-阿拉伯糖代谢能力显著提高,筛选得到了稳定遗传的单菌落BSW3AP。经定量PCR分析,驯化后的菌株BSW3AP的胞内araA、araB和araD三个基因在RNA水平的表达量显著提高,适应性驯化方式有效促进了外源L-阿拉伯糖代谢途径基因的表达,提高了菌株的L-阿拉伯糖代谢能力。在BSW3AP菌株中进一步超表达内源Ga12p转运蛋白后,得到的菌株BSW3AG的L-阿拉伯糖发酵能力进一步增强,说明驯化后菌株的L-阿拉伯糖转运蛋白的转运速率低于胞内的代谢速率,转运环节仍是重要的限速步骤。在以20 g L-1的L-阿拉伯糖为唯一碳源的厌氧发酵测试中,菌株BSW3AG的最大比生长速率达到0.075 h-,L-阿拉伯糖的最大比消耗速率为0.61gh-1g-1DCW,乙醇生成速率为0.27gh-1g-1DCW,乙醇的最大得率可以达到0.43 g g-,有效扩展了酿酒酵母的底物利用范围。