论文部分内容阅读
猪链球菌(Streptococcus suis, SS)是一种严重影响养猪业发展的病原,共分为33种血清型,其中与疾病最为相关的是猪链球菌2型(SS2),也是临床分离率最高的血清型。同时,猪链球菌还是一种重要的人畜共患病病原。病原的分离鉴定是诊断疾病和开展病原学研究的前提,经典的方法是在分离培养的基础上,开展病原的鉴定,由于猪链球菌比较容易失活,导致病料中活细菌的数量较少,分离率较低,影响和限制了有关病原菌的深层次探索和研究。建立快速、敏感和特异的检测方法,对该病的诊断及研究具重要意义。为建立一种新型检测方法,本实验作了如下探索。用纯化的重组MRP蛋白抗原免疫Balb/c小鼠,制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞系融合,经间接ELISA检测方法筛选和有限稀释法克隆化,获得2株能稳定分泌抗MRP蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为7H1和3B11,抗体亚类均为IgG2bκ,诱生腹水的抗体效价均为106。间接ELISA检测特异性表明,2株单克隆抗体与其他不同血清型菌株无交叉反应；免疫印迹(western blot)分析,只有7H1能与重组MRP蛋白和HA9801菌体均产生特异性蛋白条带,而3B11只能与重组MRP蛋白产生特异性蛋白条带。纯化后的重组MRP蛋白纯度较高,达到筛选要求。表达的MRP筛选的阳性单克隆抗体不仅可以与重组表达的MRP反应,而且可与菌体反应,便于今后检测应用。制备了纯度和特异性较高的猪链球菌2型HA9801多克隆抗体。以猪链球菌2型MRP蛋白单克隆抗体为捕获抗体包被磁珠,以多克隆抗体为检测抗体,检测猪链球菌2型抗原。试验确定单抗和多抗的最佳工作浓度分别为5μg/mL和6.25μg/mL,抗原捕获及多抗作用时间均为30min,酶标二抗最佳稀释度为1：15000,制备好的免疫磁珠保存期为5个月,最终确立了猪链球菌2型磁珠夹心ELISA方法。该方法特异性较高,检测实验室保存的存在抗原交叉性的菌株时不出现阳性反应。敏感性尚可,最低可在抗原量103CFU/mL时显示阳性反应。对人工感染病料的检测结果与PCR检测的符合率为69.23%,但敏感性与PCR方法有一定差距。