【摘 要】
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MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在22~24nt的内源性非编码小RNA,大量研究发现miRNAs在脂肪代谢和前体脂肪细胞的分化过程中具有重要的作用。研究证实COUP-TFⅡ是miR-194-5p的一
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MicroRNAs(miRNAs)是一类长度在22~24nt的内源性非编码小RNA,大量研究发现miRNAs在脂肪代谢和前体脂肪细胞的分化过程中具有重要的作用。研究证实COUP-TFⅡ是miR-194-5p的一个靶基因,过表达COUP-TFⅡ能够抑制3T3-L1细胞的分化,推测miR-194-5p可能参与调控前体脂肪细胞的分化过程。经预测发现MAP3K3是miR-194-5p的另一个靶基因。MAP3K3能够激活MEK5,后者进一步激活ERK5,ERK5能够导致PPARγ的磷酸化,从而抑制前体脂肪细胞的分化。为了探究miR-194-5p对家兔前体脂肪细胞分化的影响和作用,本试验分离培养了家兔前体脂肪细胞,利用人工合成的miR-194-5p类似物转染家兔前体脂肪细胞后诱导其分化,检测了分化过程中细胞内脂滴含量以及成脂分化相关基因mRNA水平的变化。为了验证miR-194-5p与MAP3K3基因潜在的靶向关系,试验构建了pmir-GLO-MAP3K3-3’UTR和pmir-GLO-Mut-MAP3K3-3’UTR重组质粒,通过双荧光素酶系统检测荧光素酶活性,来检测miR-194-5p与MAP3K3结合情况。为了进一步探究MAP3K3基因对家兔前体脂肪细胞分化的影响,利用siRNA抑制MAP3K3基因在细胞中的表达,并检测细胞分化过程中脂滴变化和相关基因mRNA水平的变化。然后利用Westernblotting方法分别检测了过表达miR-194-5p或抑制MAP3K3表达后,PPARγ和MAP3K3蛋白水平的变化。所有结果如下:(1)诱导家兔前体脂肪细胞分化的过程中,miR-194-5p的表达量逐渐上升,分化第5 d、9 d时表达量极显著高于0 d(p<0.01),且9 d时表达量最高。(2)转染miR-194-5p mimic显著上调了细胞内miR-194-5p的表达(p<0.01)。过表达miR-194-5p后,细胞内脂滴形成增多,甘油三酯的含量增加(p<0.05),分化相关基因C/EBPα和PPARγ基因的mRNA水平均显著上升(p<0.05)。不同的是,过表达miR-194-5p,MAP3K3、MEK5和ERK5基因的表达量下降。(3)靶基因预测显示MAP3K3是miR-194-5p潜在的靶基因,且结合位点具有一定的物种保守性,进一步采用双荧光素酶系统分析发现,miR-194-5p能够直接靶向MAP3K3,极显著地下调了萤火虫荧光素酶的活性(p<0.01)。(4)采用siRNA抑制细胞内MAP3K3基因的表达,MAP3K3表达量下降了约60%,显著抑制了下游基因MEK5和ERK5的表达(p<0.05);抑制MAP3K3基因的表达,极显著促进了细胞内脂滴的聚集(p<0.01),分化相关基因C/EBPα和PPARγ的表达水平极显著上升(p<0.01)。Western-blotting结果显示,过表达miR-194-5p和抑制MAP3K3基因表达具有一致的结果,均下调了MAP3K3蛋白表达水平,但上调了PPARγ蛋白表达水平。以上结果都表明,在家兔前体脂肪细胞分化过程中,miR-194-5p通过靶向MAP3K3促进了家兔前体脂肪细胞的分化。
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