人细胞色素P450(CYP)超家族是一类混合功能单加氧酶，主要存在于肝微粒体中，参与内源性化合物(如胆汁酸、甾体类激素、脂肪酸、前列腺素等)和外源性化合物(药物、致癌物、毒物前致突变物)的生物转化。按照CYP一级结构同源性的差异，CYPs可分成多个家族。其中CYP3A家族约占CYPs总量的30％，与其他家族相比，CYP3A酶蛋白的含量在肝微粒体中占有较高的比例且存在多种形式(例如：CYP3A4，CPY3A7，CYP3A43等)。已知CYP3A4占肝脏及肠道中CYPs总含量的50％以上，负责代谢约50％的常用临床药物，因此其重要性不容忽视。研究发现，CYP3A4个体之间酶活性具有明显的差异。很多因素造成了CYP3A4差异化的表现，包括性别、药物、内源性物质、环境化学物质等。个体间在肝脏酶表达量的差异约有40倍，在药物代谢能力方面相差也达到10倍左右。非同义单核苷酸多态性(SNPs)是造成CYP3A4个体间差异达30～85％的主要遗传因素。　　 目前，已公布的CYP3A4 SNPs多达几十种，与野生型酶活相比，这些SNPs造成了酶活性不同程度地提高或降低。http：//www.cypalleles.ki.se上公布了CYP3A4两种新非同义突变(F176V、I223R)，但是这两种突变是否影响CYP3A4酶活性至今未见报道。为了研究F176V和I223R突变是否对CYP3A4酶活性造成影响，在实验室已有CYP3A4野生型cDNA模板的基础上，利用定点突变的方法分别引入两个等位基因的突变位点，然后在内切酶KpnⅠ和XhoⅠ的作用下产生带有粘性末端的插入片段，此片段与同样经过KpnⅠ和XhoⅠ作用而带有粘性末端的pYES2/CT载体连接，构成的重组质粒热激转化导入大肠杆菌中。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性标记，因此在LB-Amp平板可筛选出重组子。KpnⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒进行初步鉴定正确后，再经测序确认。突变引入成功的质粒，经过电转将质粒导入带有CPR(CYP氧化还原酶)基因的酵母菌株中。经过Western-blotting鉴定的重组子以半乳糖大量诱导，将收获的菌体用差速离心法制备酵母微粒体，用于酶促反应动力学以及药物药物相互作用(DDIs)的研究。实验选择的特异荧光底物DBF(Dibenzyl fluorescein)在CYP3A4的作用下去甲基化产生荧光产物。酶动力学实验中所得数据经过产物标准曲线换算，应用软件GraphPad Prismd得到动力学参数Km、Vmax和内在清除率CLint(CLint=Vmax/Km)，CLint是比较突变重组酶与野生型重组酶代谢差异的标准。此外，我们选取了8大类八种药物对CYP3A4野生型和两个突变型进行了药物抑制实验。　　 实验结果显示，两种CYP3A4的突变重组酶均代谢DBF生成相应产物。但是其Km与野生型相比均有所增大，Vmax与野生型相比有所下降。F176V、I223R的CLing与野生型相比，分别为野生型的27％和22％。药物抑制实验结果显示，一种药物对不同重组酶的抑制程度不一，但是差异并不显著；不同药物对同种重组酶的抑制亦有不同。本研究对F176V、I223R进行了酶学及药物抑制作用初步分析，为今后的实验奠定了可靠的理论基础。