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目的：建立快速、准确、灵敏的液相色谱-质谱联用分析方法对茯苓皮醇提物的化学成分进行全面的检测和鉴定，在此基础上根据中药血清药物化学的研究理论及方法，对大鼠口服茯苓皮提取物后血液中的移行成分进行鉴定和表征，以期为阐释茯苓皮的药效物质基础提供科学依据。并建立一种基于高效液相柱后衍生快速筛选抑制酪氨酸酶活性成分的在线检测方法，为高通量筛选酪氨酸酶的靶向抑制剂提供技术支撑。
方法：1)首先，对提取茯苓皮中三萜类成分的最佳提取方法进行考察，然后分别对供试品溶液的洗脱体系、色谱柱的柱温等色谱条件和碰撞能、离子扫描范围等质谱条件进行考察，快速建立茯苓皮提取物体外化学成分的分析方法，结合Xcalibur 3.0质谱工作站，通过与对照品以及大量文献进行对比，并结合MassFrontier辅助解析软件，对茯苓皮甲醇提取物中所含的三萜类成分进行初步鉴定和裂解规律探讨。
2）采用灌胃给药方式，给SPF级雄性和雌性SD大鼠口服灌胃茯苓皮提取物溶液，分别对采血方式、给药剂量、蛋白沉淀方法、采血时间等进行考察，结合体外化学成分鉴定结果，进一步建立茯苓皮提取物的血液中移行成分的分析方法，通过比较雌性和雄性大鼠的含药血清、空白血清以及茯苓皮提取液的特征图谱，结合质谱 Xcalibur 3.0 工作站，以及Metwork软件，初步鉴定和表征大鼠口服茯苓皮提取物后的血中移行成分
3）在离线条件下探讨反应时间、pH、有机溶剂等因素对酪氨酸酶活性的影响，建立离线条件下最佳检测体系，并将离线条件过渡到在线检测方法的建立，研究流速、反应管体积等因素的影响，建立在线检测系统；先使用已知酪氨酸酶抑制剂验证该系统的重复性与稳定性，再对大量标准品进行筛选，探讨酪氨酸酶抑制剂的结构特征，进而对复杂提取物进行筛选。
结果：1）确定茯苓皮中三萜类成分的最佳提取方法为：加入10倍量甲醇，超声提取三次，每次20 min。最佳色谱条件为：色谱柱Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸的水溶液，流动相洗脱程序：0-5 min、65%A，5-10 min、65%-72%A，10-55 min、72%-80%A，55-90 min、80%-100%A，90-100 min、100%A；进样量：10μL；柱温：30℃。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正、负离子扫描（ESI+、ESI-）；离子源温度300℃；鞘气40 arb ；辅助气10 arb；喷雾电压：ESI+（3.5 kV），ESI-（3 kV）；毛细管温度350℃；质量分析器FT-MS Orbitrap；质量范围为m/z 100-1000；碰撞能量：正离子模式35 ev，负离子模式80 ev；扫描方式：动态数据依赖性扫描；流动相采用 DAD 检测器后分流法，分流比 1:4。利用已建立的茯苓皮提取物体外化学成分分析方法，茯苓皮中的三萜类化学成分获得了良好的分离度和检测灵敏度，通过对其化学成分图谱的分析，共鉴定出40个三萜类化合物，主要分为羊毛甾-8-烯型、羊毛甾-7，9（11）-二烯型、3，4-开环-羊毛甾-7，9（11）-二烯型、3，4-开环-羊毛甾-8-烯型三萜四种类型。
2）确定大鼠给药剂量为1.5 g/kg，连续给药三次，每次间隔1小时，于第三次给药后1小时腹主动脉取血，甲醇沉淀法作为血清样品的前处理方法，进一步系统、全面地建立了茯苓皮提化物血中移行成分分析方法，得到的含药血清图谱中入血成分多、分离效果好，同时将雌、雄大鼠进行对比，发现雌雄大鼠之间的移行成分存在差异。在雄性大鼠中血液中检测到3个代谢产物，7个原型成分，在雌性大鼠中血液中检测到3个代谢产物，7个原型成分，还有一个内源性成分的分泌明显上升。
3）离线体系中，结果表明5 mmol/L L-DOPA溶液，20 mmol/L PBS （pH 6.8），30℃条件下温育10 min，150 U/mL酪氨酸酶溶液的条件下测定的抑制率效果最好；当体系中甲醇浓度在20%以内，酪氨酸酶活性基本不受甲醇的影响，当甲醇浓度增加到40%，酪氨酸酶几乎完全失活，甲醇浓度在30%的时候，酪氨酸酶活性减半，因而确定：体系中甲醇的浓度必须控制在30%以内；酪氨酸酶活性受0.1%甲酸-水溶液影响比较大，当0.1%甲酸-水溶液在体系中所占比例达到 30%时，酪氨酸酶几乎完全失活。在线体系中，酪氨酸酶浓度30 U/mL，L-DOPA浓度5 mmol/L，酶溶液流速0.15 mL/min，L-DOPA流速0.14 mL/min，反应管体积0.5 mL时为最佳条 件。用于筛选复杂提取物中酪氨酸酶抑制剂时，发现茶叶中有两个活性成分ECG和EGCG。
结论：本实验利用液质联用技术对茯苓皮甲醇提取物中所含的化学成分进行了全面地鉴定和表征，探讨其化合物的裂解方式和途径，为三萜类化合物的结构鉴定与药效物质基础研究提供质谱依据；基于中药血清药物化学的研究理论及方法，明确了茯苓皮提取物的血中移行成分，并发现雌雄大鼠之间存在一定的差异；建立了一种快速、灵敏、稳定、重现性好的UPLC-BCD方法，虽然该方法不适宜于茯苓皮美白活性成分的检测，但是该方法具有创新性、实用性，能够广泛用于筛选中药及其他复杂提取物中的影响酪氨酸酶活性的成分，为酪氨酸酶靶向制剂的研究与筛选提供了一种新方法。
方法：1)首先，对提取茯苓皮中三萜类成分的最佳提取方法进行考察，然后分别对供试品溶液的洗脱体系、色谱柱的柱温等色谱条件和碰撞能、离子扫描范围等质谱条件进行考察，快速建立茯苓皮提取物体外化学成分的分析方法，结合Xcalibur 3.0质谱工作站，通过与对照品以及大量文献进行对比，并结合MassFrontier辅助解析软件，对茯苓皮甲醇提取物中所含的三萜类成分进行初步鉴定和裂解规律探讨。
2）采用灌胃给药方式，给SPF级雄性和雌性SD大鼠口服灌胃茯苓皮提取物溶液，分别对采血方式、给药剂量、蛋白沉淀方法、采血时间等进行考察，结合体外化学成分鉴定结果，进一步建立茯苓皮提取物的血液中移行成分的分析方法，通过比较雌性和雄性大鼠的含药血清、空白血清以及茯苓皮提取液的特征图谱，结合质谱 Xcalibur 3.0 工作站，以及Metwork软件，初步鉴定和表征大鼠口服茯苓皮提取物后的血中移行成分
3）在离线条件下探讨反应时间、pH、有机溶剂等因素对酪氨酸酶活性的影响，建立离线条件下最佳检测体系，并将离线条件过渡到在线检测方法的建立，研究流速、反应管体积等因素的影响，建立在线检测系统；先使用已知酪氨酸酶抑制剂验证该系统的重复性与稳定性，再对大量标准品进行筛选，探讨酪氨酸酶抑制剂的结构特征，进而对复杂提取物进行筛选。
结果：1）确定茯苓皮中三萜类成分的最佳提取方法为：加入10倍量甲醇，超声提取三次，每次20 min。最佳色谱条件为：色谱柱Athena C18 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：A为甲醇，B为0.1%甲酸的水溶液，流动相洗脱程序：0-5 min、65%A，5-10 min、65%-72%A，10-55 min、72%-80%A，55-90 min、80%-100%A，90-100 min、100%A；进样量：10μL；柱温：30℃。质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为正、负离子扫描（ESI+、ESI-）；离子源温度300℃；鞘气40 arb ；辅助气10 arb；喷雾电压：ESI+（3.5 kV），ESI-（3 kV）；毛细管温度350℃；质量分析器FT-MS Orbitrap；质量范围为m/z 100-1000；碰撞能量：正离子模式35 ev，负离子模式80 ev；扫描方式：动态数据依赖性扫描；流动相采用 DAD 检测器后分流法，分流比 1:4。利用已建立的茯苓皮提取物体外化学成分分析方法，茯苓皮中的三萜类化学成分获得了良好的分离度和检测灵敏度，通过对其化学成分图谱的分析，共鉴定出40个三萜类化合物，主要分为羊毛甾-8-烯型、羊毛甾-7，9（11）-二烯型、3，4-开环-羊毛甾-7，9（11）-二烯型、3，4-开环-羊毛甾-8-烯型三萜四种类型。
2）确定大鼠给药剂量为1.5 g/kg，连续给药三次，每次间隔1小时，于第三次给药后1小时腹主动脉取血，甲醇沉淀法作为血清样品的前处理方法，进一步系统、全面地建立了茯苓皮提化物血中移行成分分析方法，得到的含药血清图谱中入血成分多、分离效果好，同时将雌、雄大鼠进行对比，发现雌雄大鼠之间的移行成分存在差异。在雄性大鼠中血液中检测到3个代谢产物，7个原型成分，在雌性大鼠中血液中检测到3个代谢产物，7个原型成分，还有一个内源性成分的分泌明显上升。
3）离线体系中，结果表明5 mmol/L L-DOPA溶液，20 mmol/L PBS （pH 6.8），30℃条件下温育10 min，150 U/mL酪氨酸酶溶液的条件下测定的抑制率效果最好；当体系中甲醇浓度在20%以内，酪氨酸酶活性基本不受甲醇的影响，当甲醇浓度增加到40%，酪氨酸酶几乎完全失活，甲醇浓度在30%的时候，酪氨酸酶活性减半，因而确定：体系中甲醇的浓度必须控制在30%以内；酪氨酸酶活性受0.1%甲酸-水溶液影响比较大，当0.1%甲酸-水溶液在体系中所占比例达到 30%时，酪氨酸酶几乎完全失活。在线体系中，酪氨酸酶浓度30 U/mL，L-DOPA浓度5 mmol/L，酶溶液流速0.15 mL/min，L-DOPA流速0.14 mL/min，反应管体积0.5 mL时为最佳条 件。用于筛选复杂提取物中酪氨酸酶抑制剂时，发现茶叶中有两个活性成分ECG和EGCG。
结论：本实验利用液质联用技术对茯苓皮甲醇提取物中所含的化学成分进行了全面地鉴定和表征，探讨其化合物的裂解方式和途径，为三萜类化合物的结构鉴定与药效物质基础研究提供质谱依据；基于中药血清药物化学的研究理论及方法，明确了茯苓皮提取物的血中移行成分，并发现雌雄大鼠之间存在一定的差异；建立了一种快速、灵敏、稳定、重现性好的UPLC-BCD方法，虽然该方法不适宜于茯苓皮美白活性成分的检测，但是该方法具有创新性、实用性，能够广泛用于筛选中药及其他复杂提取物中的影响酪氨酸酶活性的成分，为酪氨酸酶靶向制剂的研究与筛选提供了一种新方法。