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瓦伦西亚烯和圆柚酮都属于天然的倍半萜类化合物。瓦伦西亚烯是柑橘类水果和柑橘类香料的香气成分,并且是圆柚酮的重要前体化合物。圆柚酮也具有独特的芳香气味。因此,瓦伦西亚烯和圆柚酮被广泛应用于食品、饮料、香精、香料行业,具有很高的市场价值。圆柚酮以喷雾形式存在时,具有良好的杀虫效果。最新研究表明,圆柚酮具有抑制癌细胞增生和抗血小板凝集的作用。近年来,合成生物学的发展,使得通过代谢工程改造微生物,生产结构复杂的高附加值化合物变得极具吸引力。本课题首先引入来源于纯天仙子的细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450monooxygenase,CYP450)HPO、来源于黄扁柏的瓦伦西亚烯氧化酶(valencene oxidase)CnVO并构建了它们对应的四个突变体HPOM,CnVO-1,CnVO-2,CnVO-3,与来源于拟南芥的细胞色素还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)AtCPR组合表达。以酿酒酵母CEN.PK2-1Ca为宿主菌株,通过静息细胞实验,得到HPO的催化效果最佳,对瓦伦西亚烯的转化率达到10.73%(mol/mol)。且发现HPO和AtCPR共表达在同一载体上时,其催化效率和稳定性比两者分别表达在两个质粒上时有了显著提高,圆柚醇、圆柚酮的产量分别达108.0 mg/L乙酸乙酯,19.1 mg/L乙酸乙酯。为了进一步提高圆柚酮的产量,本研究从酿酒酵母基因组扩增得到两种醇脱氢酶ADH1和ADH3,在宿主菌株中分别过表达这两种脱氢酶,发现ADH1的过表达显著提高了圆柚醇、圆柚酮的产量,总萜转化率达到49.1%。故本研究初步成功构建了生物半合成圆柚酮的工程菌株。为解决外源添加底物的强挥发性问题,本研究引入来自黄扁柏的瓦伦西亚烯合成酶基因CnVS,利用酿酒酵母原位生产瓦伦西亚烯,内源产量达2.60±0.23 mg/L。为了提高瓦伦西亚烯的产量,本研究结合代谢工程的策略,包括下调ERG9,敲除ROX1,过表达tHMGR,更换启动子,最终瓦伦西亚烯的产量达到28.97 mg/L,提高了10倍。基于此,同时表达HPO,AtCPR和ADH1基因,瓦伦西亚烯和圆柚醇产量分别达20.6,24.5 mg/L。旨在进一步提高总萜产量,本研究针对诱导培养基,培养温度条件做了优化,最终确定诱导培养基为SG,培养温度为25 ~o C,发酵时间延长时,摇瓶水平总萜产量达130.5 mg/L。最后,基于此培养条件,选择最佳组合的工程菌株PK2-24,上罐发酵,总萜产量达310.94 mg/L,较之原始菌株的2.79 mg/L,提高了约111倍。遗憾的是,没有检测到圆柚酮。本研究为未来利用工程酵母发酵的方法规模化生产瓦伦西亚烯及其衍生物奠定了重要基础。