非结核分枝杆菌(NTM)是指除麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群以外的其他分枝杆菌属细菌的统称。有统计的NTM菌种已经超过160种，能够引起人类感染的NTM也已近百种。随着NTM病例的逐年增多，加之目前尚缺少准确完善的NTM疾病诊治指南，如何能够快速高效的开展NTM分离株的菌种鉴定和体外药物敏感试验，对临床诊疗意义重大。传统依赖细菌的培养特性和生化反应来鉴定菌种的方法存在一定的缺陷，而分子生物学技术的应用则能够在基因水平完成菌种鉴定，使结果更加准确高效。多位点序列分析(MLSA)是近些年来兴起的一种新型细菌菌种鉴定技术，国内外已有相关的研究报道。本研究旨在对快速准确的鉴定NTM分离株并开展药敏试验的方法进行探讨，为NTM感染性疾病的临床诊治提供科学依据。　　本研究收集到42例临床疑似非结核分枝杆菌感染患者的临床样本，采用染色镜检和固体和/或液体培养方法进行分枝杆菌检查和分离培养，使用对硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)两种鉴别培养基和多位点PCR方法对分离到的分枝杆菌进行初步鉴定，随后选取16S rRNA、hsp65、 rpoB等管家基因位点进行PCR扩增测序和序列比对以鉴定菌种，其中6株临床分离株最终经MLSA方法确认菌种为马西利亚分枝杆菌;在完成菌种鉴定后本研究仍对部分临床分离株开展微孔板法体外药物敏感性试验以协助临床治疗;另外，复苏接种了中国疾病预防控制中心传染病预防控制所菌株库冻存保藏的144种251株分枝杆菌国际参照菌株，分别对16S rRNA、16S-23S ITS、dnaJ、 hsp65、 rpoB和sodA共6个管家基因位点进行PCR扩增和测序;汇总整理管家基因的序列信息，通过拼接、调整后进行比对，按照多位点序列分析(MLSA)方法构建系统聚类图，评价MLSA方法在NTM疾病菌种鉴定中的作用。　　本研究在对临床样本分离培养和菌种鉴定后，最终成功分离到38株分枝杆菌，其中包括34株NTM、3株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌。34株NTM中有7株胞内分枝杆菌、6株马西利亚分枝杆菌、5株Mycobacteriumbolletii、4株脓肿分枝杆菌、2株偶发分枝杆菌、2株戈登分枝杆菌、2株罕见分枝杆菌、2株永宫分枝杆菌、1株鸟分枝杆菌、1株堪萨斯分枝杆菌、1株缓黄分枝杆菌和1株马赛分枝杆菌。体外药敏结果显示，多数NTM临床分离株对常见的抗结核药物均耐药或不敏感，部分菌株对阿米卡星、左氧氟沙星、克拉霉素、利福布丁、头孢西丁等药物敏感性好;不同分枝杆菌菌种间药物敏感性差异较大。结合菌种鉴定和体外药敏试验结果给临床诊治提供了重要参考依据。　　本研究最终完成了142种249株库存国际参照菌株的复苏与16S rRNA、16S-23S ITS、dnaJ、 hsp65、 rpoB和sodA6个基因的扩增测序分析。参照胞内分枝杆菌国际参照菌株ATCC13950调整序列并作可视化分析后，hsp65和sodA基因序列中各参照菌株的匹配情况较好，16S-23S ITS基因序列中各参照菌株的匹配情况较差。同时完成了hsp65和sodA两个基因的聚类分析，结果显示各参照菌株大都聚类成为快速生长分枝杆菌(RGM)和缓慢生长分枝杆菌(SGM)两大类别。这说明MLSA方法能够用于NTM菌种鉴定，并具备将同源性较高的NTM区分鉴定的能力。　　本研究虽然受限于样本菌株数量较少，未能对NTM疾病的流行特征和药敏情况做更多分析，但在国内首次发现永宫分枝杆菌病例和不同NTM菌种多重感染的情况，在一定程度上补充了国内对于NTM感染研究的相关数据。并通过探讨MLSA方法在NTM菌种鉴定中的应用，为快速准确进行NTM菌种鉴定提供了新的思路。