随着工业社会的迅速发展,以果糖玉米糖浆为主要甜味剂的各类食物风靡全球。一系列研究证实过量果糖摄取与代谢综合征(MS)发生密切相关,它可通过诱导胰岛素抵抗、氧化应激和炎症反应参与肾脏足细胞损伤和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)等病理过程。因此,研究高果糖诱导胰岛素抵抗、氧化应激和炎症反应与代谢性疾病之间复杂关系将有助于揭示疾病新的病理机制、发现新的药物靶点,具有重要的理论和实践意义。中药多酚类物质具有广泛的生物活性备受重视。已有报道姜黄素、虎杖苷、紫檀茋、槲皮素具有抗氧化应激和减轻炎症反应等作用,可改善糖尿病、心血管疾病、慢性肾脏疾病和NAFLD等代谢性相关疾病。本文在课题组已证实中药多酚类成分具有显著改善MS模型动物特征性病理的基础上,结合药理学、生物化学、细胞生物学、分子生物学等研究方法和技术,以胰岛素抵抗、氧化应激和炎症反应等MS特征性病理研究为切入点,在动物和细胞模型上重点研究高果糖与足细胞损伤之间潜在的联系及新的病理机制,并探索高果糖、高葡萄糖对肝脏炎症反应和脂质积累新的作用途径;在此基础上各有侧重研究姜黄素、虎杖苷、紫檀茋、槲皮素对肾小球足细胞损伤和(或)NAFLD的保护作用,探索其抗代谢性疾病新的靶点和调控机制。本文首先在果糖MS模型大鼠观察到足细胞的病理改变。发现果糖过量摄取可引起大鼠足细胞足突融合,同时伴随着血清尿酸水平的增加和尿微量白蛋白水平的升高以及肾小球Podocin蛋白表达的显著下降等,进一步明确高果糖摄入与肾脏足细胞损伤和功能紊乱存在密切的关联。而姜黄素、虎杖苷和紫檀茋在不同程度上缓解果糖所诱导大鼠足细胞损伤,降低血清尿酸和尿微量白蛋白水平,逆转Podocin蛋白表达异常,具有足细胞保护作用。为研究果糖MS模型大鼠足细胞损伤与微小RNA-miR-206表达异常和胰岛素抵抗的关联,以及中药多酚类成分对足细胞损伤的保护机制,本文在证实果糖MS大鼠模型呈现高胰岛素血症、胰岛素抵抗等基础上,发现高果糖摄入能抑制大鼠肾脏miR-206表达水平,上调肾小球蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)蛋白表达,而损伤肾小球胰岛素信号通路—胰岛素受体底物-1/丝氨酸/苏氨酸激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2(IRS-1/Akt/ERK1/2)通路,引起足细胞结构和功能异常,诱发蛋白尿。另外,在体外培养足细胞系HSMPs模型中进一步证实,高果糖(5 mM)作用足细胞4 h后可下调miR-206表达水平,作用8 h后上调PTP1B蛋白水平;并发现足细胞瞬时转染miR-206 mimic 48 h后,其PTP1B蛋白表达水平显著下调并逆转果糖诱导PTP1B蛋白的过表达,提示miR-206可能直接调控高果糖所影响的足细胞PTP1B蛋白表达变化。同时经高果糖和胰岛素处理不同时间后,也观察到足细胞IRS-1、Akt和ERK1/2蛋白磷酸化水平显著的降低,提示高果糖处理可直接引起足细胞胰岛素敏感性的降低。这些研究结果表明果糖过量摄入抑制足细胞miR-206表达水平,上调PTP1B蛋白表达,改变IRS-1/Akt/ERK1/2胰岛素信号通路正常传导,导致足细胞胰岛素敏感性降低和胰岛素抵抗发生,而损伤足细胞产生蛋白尿。在这些中药多酚类成分中,姜黄素能上调果糖MS大鼠肾脏和果糖处理足细胞miR-206表达水平,逆转PTP1B蛋白表达变化,改善果糖MS大鼠肾小球和足细胞胰岛素信号通路IRS-1/Akt/ERK1/2,增加胰岛素敏感性和降低胰岛素抵抗,缓解高果糖诱发的足细胞损伤和蛋白尿。为探索果糖MS模型大鼠足细胞损伤与氧化应激和炎症反应及其相关miR-377表达异常的关联,本文首先证实果糖过量摄入能引起大鼠肾脏产生氧化应激反应,主要表现在肾脏丙二醛(MDA)水平的升高、超氧化物歧化酶(SOD)活性的下降、活性氧(ROS)过多产生、超氧化物歧化酶1(SOD1)和SOD2蛋白水平的下降、以及肾小球p38丝裂素活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平和硫氧还原蛋白结合蛋白(TXNIP)蛋白水平的升高。也观察到模型动物肾脏炎症反应以及一些炎症因子如NOD样受体蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)、白细胞介素-1β(L-1β)蛋白水平的升高。其次,发现果糖过量摄入能引起大鼠肾脏miR-377水平的提高。在体外培养足细胞系HSMPs模型上进一步证实,高果糖(5 mM)处理足细胞4 h后能上调miR-377表达水平,抑制SOD1和SOD2蛋白表达,升高胞内ROS和尿酸水平。另外,高果糖(5mM)能上调p38 MAPK磷酸化水平(48 h)和TXNIP(72 h)蛋白表达水平。而p38 MAPK特异性抑制剂SB203580作用足细胞48h后,可阻断果糖所诱导TXNIP蛋白的高表达,提示p38MAPK参与了果糖诱导足细胞TXNIP过表达过程。高果糖(5mM)还能激活足细胞NLRP3炎性体(72 h)和增加足细胞IL-1β表达和分泌(96 h)。而siRNA-TXNIP可逆转高果糖对足细胞NLRP3炎性体的激活作用,提示TXNIP参与了果糖所诱导足细胞NLRP3炎性体激活过程。上述研究结果表明,高果糖可上调足细胞miR-377表达和胞内尿酸水平,抑制SOD1和SOD2蛋白表达,升高细胞内ROS水平,激活ROS/p38/TXNIP/NLRP3通路诱导足细胞产生炎症反应,导致足细胞损伤和蛋白尿产生。在这些中药多酚类成分中,虎杖苷和紫檀茋可抑制果糖MS大鼠肾脏MDA、ROS和血清尿酸水平、上调SOD活性。并发现它们抑制果糖MS大鼠肾脏和足细胞miR-377表达水平,上调果糖模型大鼠肾小球和足细胞SOD1和SOD2蛋白表达,下调足细胞尿酸水平,抑制足细胞ROS/p38/TXNIP/NLRP3通路,改善果糖诱导的足细胞炎症反应及损伤。为进一步探询脂肪肝发生发展的病理过程及中药多酚类成分干预作用,本文在证实果糖MS大鼠模型呈现高血清和肝脏甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平及低血清高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平等脂代谢紊乱、及高瘦素血症、胰岛素和瘦素抵抗、肝脏炎症和脂肪肝等NAFLD特征性病理改变等基础上,发现果糖过量摄入可抑制动物肝脏miR-203表达,这可导致其靶基因细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)蛋白水平的上调。而SOCS3过表达在损害肝脏Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/信号转导子与转录激活子3(STAT3)瘦素信号通路的同时也诱导胰岛素信号通路IRS1-Akt-ERK1/2障碍,进而使脂质代谢相关蛋白表达异常如过氧化物酶体增殖物激活型受体α(PPARα)的抑制和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的上调,引起肝细胞脂代谢紊乱和脂质堆积,诱发NAFLD。紫檀茋能逆转高果糖摄入对miR-203的抑制,下调SOCS3蛋白水平,从而提高胰岛素和瘦素敏感性及调控脂质代谢相关蛋白表达,有效调节模型动物脂代谢紊乱,改善高果糖摄入诱导动物肝细胞脂质沉积。另一方面,本文研究槲皮素对体外高葡萄糖(30 mM)诱导肝细胞炎症反应和脂质代谢紊乱的调节作用。发现槲皮素作用BRL-3A肝细胞系48 h或作用HepG2肝细胞系24 h能显著抑制高葡萄糖诱导TXNEP蛋白的过表达和NLRP3炎性体的激活。而siRNA-TXNIP逆转了高葡萄糖对肝细胞NLRP3炎性体的激活作用,提示槲皮素通过下调TXNIP蛋白表达抑制高糖诱导肝细胞NLRP3炎性体的激活。此外,siRNA-TXNIP可阻断高葡萄糖对肝细胞PPARα蛋白表达的抑制作用,同时也削弱槲皮素对高葡萄糖条件下肝细胞PPARα蛋白的调节作用,提示槲皮素可能部分地通过抑制TXNIP调节高葡萄糖条件下肝细胞PPARα蛋白表达。槲皮素能抑制高糖所刺激肝细胞SREBP-1c、SREBP-2、脂肪酸合成酶(FAS)和肝X受体α(LXRα)蛋白表达的异常,但在caspase-1抑制剂Ac-YVAD-CMK存在条件下,它能下调高葡萄糖状态下肝细胞FAS和LXRα蛋白表达的升高。这些研究结果提示槲皮素可能部分通过调节TXNIP-NLRP3-SREBPs通路以改善与糖尿病相关的NAFLD。综上所述,高果糖可抑制足细胞miR-206表达以上调PTP1B表达,损害足细胞胰岛素信号通路IRS-1/Akt/ERK1/2,使足细胞胰岛素敏感性降低而产生胰岛素抵抗。另外,高果糖上调足细胞miR-377表达,抑制SOD1和SOD2表达,激活ROS/p38/TXNIP/NLRP3通路诱导足细胞产生氧化应激和炎症反应。这些病理过程进而导致足细胞损伤和蛋白尿产生。姜黄素可上调足细胞miR-206表达,抑制PTP1B蛋白表达,改善果糖损伤的足细胞IRS1-Akt-ERK1/2通路,增加胰岛素敏感性和减轻胰岛素抵抗,缓解高果糖所诱导产生的足细胞损伤和蛋白尿。而虎杖苷和紫檀茋则抑制足细胞miR-377表达,上调SOD1和SOD2表达,抑制ROS/p38/TXNIP/NLRP3通路的激活,改善高果糖所诱导的足细胞氧化应激和炎症反应,具有足细胞保护作用。另外,紫檀茋上调果糖MS大鼠肝脏miR-203表达,抑制SOCS3蛋白过表达,改善肝脏胰岛素敏感性,减轻肝脏脂质积累。槲皮素下调高葡萄糖所诱导肝细胞TXNIP蛋白高表达以抑制NLRP3炎性体的激活,减轻炎症反应,调节脂代谢蛋白表达,改善与糖尿病相关的NAFLD。本文研究工作为这些中药多酚类成分用于临床防治MS肾脏足细胞损伤和肝脏脂质沉积等提供了实验和理论依据。