F-Box蛋白SlAMR1调控番茄抗坏血酸合成的机理研究

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植物总是会受到非生物和生物胁迫的伤害,胁迫环境不利于它们的生长发育。抗坏血酸是植物体内重要的抗氧化剂,通过清除逆境产生的过量ROS,在植物抵抗逆境所造成的损害中发挥着至关重要的作用。抗坏血酸对人体也有着非常重要的作用,且人体自身不能合成抗坏血酸,只能通过含抗坏血酸含量高的水果蔬菜获取。目前,对主要的模式作物如拟南芥、番茄等,研究人员对于抗坏血酸的合成代谢研究已经取得很大进展,抗坏血酸在高等植物中的合成途径已经基本确定,但是关于调控因子影响植物抗坏血酸含量方面进展较少。前人报道拟南芥中AMR1调控因子对叶片抗坏血酸合成有负调控作用,但调控机制尚不明确。本文根据拟南芥中抗坏血酸调控因子AtAMR1的番茄同源基因SlAMR1,研究其对番茄浆果中抗坏血酸合成代谢的调控机制,具有一定的科学意义和重要的应用价值。  AMR1最早是在拟南芥中发现的第一个抗坏血酸调控因子,特异地在D-Man/L-Gal途径中发挥着重要作用。本实验是拟南芥中AMR1为信息探针,在番茄Unigene数据库中搜索同源性最高且具有相同保守结构域的Unigene命名为SlAMR1。在番茄中对SlAMR1做转基因功能验证,并从生理生化和分子水平分析SlAMR1的功能及调控模式。主要研究结果如下:  1.通过转基因植株进行功能鉴定,确定SlAMR1特异性地通过D-Man/L-Gal途径调控番茄抗坏血酸含量。在转基因超量株系、干涉株系叶片和绿熟果实以及红熟果实中,相比于对照抗坏血酸含量分别表现出负调控关系,即超量表达SlAMR1减少抗坏血酸积累,干涉株系抗坏血酸积累增多,且呈显著性差异。  2.SlAMR1对番茄抗坏血酸含量的调控随着光照呈现周期性变化。通过48小时的光周期实验发现,进入黑暗环境后SlAMR1的基因表达量不断上升,与此对应,抗坏血酸的含量逐渐降低,在光照下抗坏血酸含量高于黑暗条件。  3.干涉SlAMR1的表达可提高番茄对氧化逆境的抗性。抗坏血酸通过一系列生理生化反应清除活性氧,保护植物免受一些逆境胁迫所带来的伤害。利用甲基紫精(MV)喷施处理人为地创造氧化胁迫逆境,观察逆境处理后叶绿素和丙二醛含量的变化研究SlAMR1对植株抗氧化能力的影响。对不同株系喷施MV后,与对照AC相比SlAMR1转基因干涉材料的叶绿素含量上升、丙二醛含量下降,表明抗氧化胁迫能力提高。  4.用抗坏血酸三个合成途径的不同底物饲喂处理离体叶片、果实,研究SlAMR1对抗坏血酸合成途径调控的模式。饲喂叶片和果实的结果表现比较一致,饲喂半乳糖醛酸、肌醇途径的底物时,转基因各株系以及对照的抗坏血酸含量表现与阴性对照表现相同,即维持原来的抗坏血酸差异。饲喂D-甘露糖/L-半乳糖底物之后,转基因材料以及对照之间AsA含量趋于一致,削弱了基因表达的影响。证实S1AMR1特异性调控D-Man/L-Gal途径。  5.对番茄抗坏血酸合成途径关键酶GMP和GalUR的酶活力测定。结果显示干涉SlAMR1表达可提高番茄植株中GMP酶活力;超量表达SlAMR1可在一定程度降低番茄植株中GalUR的酶活力,干涉SlAMR1表达不能改变GalUR酶活力。  6.通过酵母钓库及点对点验证,显示SlAMR1发挥功能可能通过其保守结构域F-box构成泛素E3连接酶SCF复合体发挥作用。对转基因株系做泛素表达水平检测发现,超量表达SlAMR1之后,泛素表达水平有上调趋势,与之对应的是抗坏血酸含量的下降。初步表明F-box蛋白S1AMR1通过泛素-蛋白酶复合体途径调控番茄中抗坏血酸的合成。
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