白藜芦醇,是一种非黄酮类多酚有机化合物,具有预防肿瘤、神经保护、自身免疫调控、抗哮喘、抗糖尿病等作用,有广泛的市场前景。目前白藜芦醇的主要来源是从虎杖和葡萄等植物中提取得到,然而天然植物中提取的白藜芦醇存在含量低、提取困难等问题,已经不能满足人们对它的需求,寻找其替代来源迫在眉睫。目前生物工程技术是解决白藜芦醇缺乏问题比较理想的途径,大肠杆菌、酿酒酵母等模式生物均被用作底盘生物合成白藜芦醇,但依然存在产量较低的问题。在白藜芦醇的合成途径中需要丙二酰辅酶A的参与,改造其供给代谢途径一直是提高白藜芦醇产量的重要方向,而产油微生物因为能够积累大量脂质的特性,细胞能为脂质合成提供大量丙二酰辅酶A,可能是合成白藜芦醇比较理想的模式生物。耶氏解脂酵母是目前遗传背景最清晰,基因操作工具最完善的产油微生物,本研究选取耶氏解脂酵母作为底盘生物,将白藜芦醇合成基因导入酵母细胞内,探究耶氏解脂酵母细胞合成白藜芦醇的可行性。具体研究如下:将来源于拟南芥的4-香豆酸辅酶A连接酶（At4CL）基因和葡萄的二苯乙烯合成酶（Vv STS）基因通过同源重组技术整合到耶氏解脂酵母基因组中,使其成功表达并合成白藜芦醇。首先,全基因合成启动子p TEFin和终止子t LIP2序列,酶切连接到单基因表达载体p INA1312上,使其改造成双基因表达载体p CRCylm;然后,全基因合成密码子优化后的At4CL和Vv STS基因连接到T载体上,而后分别连接到表达载体p CRCylm上,得到重组表达载体p CRCyl-At4CL-Vv STS。然后,使用醋酸锂化学转化法将表达载体成功转入到耶氏解脂酵母感受态细胞基因组中,得到生产合成白藜芦醇的重组酵母菌株。将通过PCR验证后的重组菌株和对照菌株在添加少量对香豆酸的YEPD培养基中进行摇瓶培养,探究At4CL、Vv STS基因表达对耶氏解脂酵母生长和白藜芦醇产量的影响。实验结果表明,At4CL、Vv STS基因在耶氏解脂酵母中表达使生物量从12.5 g/L降低到10.4g/L、白藜芦醇产量达到了674μg/L,说明At4CL和Vv STS基因成功转入耶氏解脂酵母中,得到的重组菌株能够合成白藜芦醇。为了进一步探究重组耶氏解脂酵母细胞生产白藜芦醇的能力,对其发酵条件进行优化。设计单个因素试验,分别探究对香豆酸添加浓度、对香豆酸添加时间、培养时间、培养温度对重组耶氏解脂酵母细胞白藜芦醇产量的影响。研究结果表明,对香豆酸添加浓度对白藜芦醇产量的影响呈现先上升后下降的趋势,在16 mg/L时产量最高;对香豆酸添加时间在12 h时,白藜芦醇产量最高;随着培养时间的增长,白藜芦醇的产量先上升后下降,在72 h时产量最高;培养温度对白藜芦醇产量有较大的影响,当培养温度为28℃时,重组酵母白藜芦醇产量最大。为了进一步提高白藜芦醇的产量,选择上述实验结果中产量变化趋势明显的三个因素进行响应面优化实验。研究结果表明,通过比较F值的大小,三因素对白藜芦醇产量影响的显著性大小顺序为:培养温度>对香豆酸添加量>对香豆酸添加时间。最终确定,重组耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的最佳培养工艺参数为对香豆酸添加量19.407 mg/L、对香豆酸添加时间11.437 h、培养温度26.2℃,重组耶氏解脂酵母合成白藜芦醇的理论值为1630.798μg/L。按照此培养条件进行发酵,并进行白藜芦醇产量的验证,经过三次重复试验,白藜芦醇产量的平均值为1604.700μg/L,与模型预测理论值仅仅相差1.59%,说明数据模型拟合度好。通过单因素与响应面优化,重组耶氏解脂酵母产量得到了进一步的提高。总之,产油微生物耶氏解脂酵母通过基因改造可以合成功能因子白藜芦醇,为研究此酵母生产功能性物质提供了理论与实践基础。