高产纤维素酶菌株选育、发酵产酶优化与初步应用研究

来源 :四川轻化工大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:dragonunderwater
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纤维素类物质是一种重要的可再生资源,高效开发利用此类物质对人类解决资源、环境等问题具有巨大意义。纤维素酶能够水解纤维素生成葡萄糖,葡萄糖可通过生物发酵转化为多种有益物质。纤维素酶在饲料、纺织、食品、医药等领域展现了良好的市场前景。纤维素酶广泛存在于微生物、原生动物和植物中,目前已发现很多具有纤维素酶合成能力的微生物,如木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)等。本研究主要从自然界筛选得到高产纤维素酶菌株,再通过复合诱变进一步选育高产菌株,然后结合培养基优化与发酵条件优化,提高该菌株在液态和固态发酵条件下的产酶能力,并初步用于油菜秸秆饲料发酵,主要结论如下:(1)从自然界腐殖土、腐木中筛选获得产纤维素酶菌株,通过刚果红染色初筛、酶活复筛的方式获得一株高产纤维素酶菌株B03,其CMC酶活达到2.37±0.02IU/mL,FPA酶活为0.26±0.01IU/mL。对菌株B03进行形态学鉴定与分子生物学鉴定,最终鉴定菌株B03为枝孢菌属(Cladosporium),命名为Cladosporium sp.B03。(2)为了进一步提高菌株Cladosporium sp.B03的产酶能力,采用紫外诱变与常压室温等离子体(ARTP)复合诱变菌株。筛选方法依然为刚果红染色初筛、酶活复筛,经紫外诱变后最佳突变菌株UV-03较原菌株CMC酶活提高18.79%,菌株UV-03进行ARTP诱变后得到突变株Cladosporium sp.AY-42,最终CMC酶活为3.23±0.01IU/mL,FPA酶活为0.51±0.02IU/mL,较原始菌株Cladosporium sp.B03CMC酶活提高36.14%,FPA酶活提高97.03%。(3)为提高Cladosporium sp.AY-42液态发酵产酶能力,优化碳源、氮源,选择油菜秸秆粉和酵母粉作为最佳碳源和氮源。然后使用PB设计对培养基成分进行显著性分析,结果显示油菜秸秆粉、MgSO4?7H2O、KH2PO4为显著影响因素。对三个显著因素进行响应面设计分析,最终最佳培养基组成为油菜秸秆粉12.5g、酵母粉2g、MgSO4?7H2O 0.75g、NaCl 0.5g、KH2PO4 5g、FeSO4?7H2O 0.01g。在最佳培养基组成条件下优化培养条件,结果表明菌株的最佳培养时间为3d,最佳接种量为5%,最适装液量为70mL,最适转速为200r/min,最佳培养温度为28℃。在最适培养条件下菌株产CMC酶活由3.23±0.01IU提高到4.20±0.06IU,比优化前酶活提高了30.03%。(4)为提高Cladosporium sp.AY-42固态发酵产酶能力,通过单因素优化确定培养基最适碳源为油菜秸秆粉:麸皮=3:2、最适氮源为(NH42SO4及最适氮源浓度为2%。固态发酵培养条件单因素优化结果为最佳料水比1:2,最适发酵温度30℃,最适培养时间4d。料水比、温度、时间的响应面优化分析结果为料水比1:1.8,温度29℃,发酵时间4天,固态发酵培养菌株CMC酶活最终达8.17±0.05IU,酶活力提高了57.72%。固态发酵油菜秸秆产菌体蛋白显示菌株Cladosporium sp.AY-42与安琪酵母共同发酵时真蛋白含量由5.75%提高到8.30%,较初始值提高了44.34%,纤维素、半纤维素的降解率为18.45%、17.41%。
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