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背景与目的人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)是1975年由Appleton和Higgins用电镜在腹泻患儿粪便标本中首次发现的,因在电镜下病毒颗粒表面呈星形,故命名为星状病毒(Astrovirus,AstV),是引起急性胃肠炎的主要病原体之一,近年来也有报道显示其与脑膜炎等神经系统疾病有关。HAstV-MLB2于2009年在腹泻儿童粪便标本中首次报道,具有传统HAstV的基本结构。造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)患者免疫功能低下、病程长,易感染各类病原且病原于宿主机体内能长期存在。其中一些病原体,尤其是RNA病毒,复制速度快且RNA聚合酶缺乏校正活性,具有很高的突变率。在患者免疫力逐渐恢复过程中,宿主免疫力对病毒产生选择性压力,导致有可能产生毒力更强的病毒株出现,这类病人被视为新型病毒的来源库。在本课题研究中,我们通过高通量测序分析,了解HSCT术后免疫功能低下患者粪便中的病毒宏基因组学,确定其中的HAstV-MLB2(HAstV-MLB2-YJMGK)的全基因组结构及评估其准种异质性,并对全球流行的HAstV分离株进行遗传和进化分析。方法通过高通量测序(MiSeq 平台,Illumina)对 10 名(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者中采集的不同时期的30份粪便样本进行测序。在利用生物信息分析平台分析获得的原始病毒序列的基础上,进一步利用Geneious等生物软件提取和分析感兴趣的HAstV-MLB2目的基因序列。根据MiSeq高通量测序获得的连续序列设计引物,通过聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)确证样本中HAstV-MLB2的存在。并针对ORF1b区设计特异性引物,扩增得到702bp片段,对采集的allo-HCST患者所有50份粪便样本进行筛查,每次PCR均设置阳性对照和阴性对照。本研究中扩增的星状病毒命名为HAstV-MLB2-YJMGK。为了获得HAstV-MLB2-YJMGK的全基因组,首先根据高通量测序得到的序列设计引物,再在得到的新序列基础上进一步设计特异性引物,继续扩增获得其它序列。利用RACE和Walking法扩增基因组的5’端和3’端。最后设计引物进行长片段扩增,对全基因组序列进行确证,并对全基因组进行序列和基因结构分析。利用ORF2的核苷酸(nt)序列,构建系统发育树。相关的参考HAstV基因组从GenBank核酸数据库下载。进化树形图由MEGA(6.0)软件,使用邻接法运行1000次绘制。使用bootscanning法在Simplot软件中检测HAstV-MLB2-YJMGK 的重组情况。利用BEAST软件(v1.8.2)中的贝叶斯马尔科夫链蒙特卡罗(Bayesian Markov Chain Monte Carlo,MCMC)法估算碱基替换率。使用 jModelTest 软件(v.2.1.7)识别最优进化模型。Akaike信息标准和等级似然比测试表明,一般时间可逆(General time reversible,GTR)+Γ(伽马分布率变化)模型最佳。使用Tracer(v.1.6)对结果进行计算和分析,数据中的统计不确定性由95%的最高概率密度(highest probability density,HPD)值反应。使用的GTR+Γ+不相关对数正态分布松弛分子钟(the uncorrelated log-normal distribution relaxed clock,UCLD)模型,在BEAST软件中,绘制种群动态模型图。利用Tracer(v.1.6)对贝叶斯线图进行分析。利用MEGA软件(v.6)将多样性量化为所有成对的核苷酸序列的平均遗传距离。使用Nei和Gojobori方法计算每个同义位点的同义替换率(DNA synonymous substitutions,dS)和每个非同义位点的非同义替换率(DNA nonsynonymous substitutions,dN),并使用MEGA软件(v.6)对多个替换进行Jukes-Cantor校正。结果 我们从30个粪便样本的高通量测序中共获得724757000个读长序列(reads),其中 447230 条为病毒序列(15.4%),852 个 reads 与 HAstV-MLB2 匹配。在初始序列的基础上,获得近全长的基因组序列HAstV-MLB2-YJMGK,共6131bp。同源性分析表明整个序列与已知的星状病毒参考株MLB2-GUP187(AB829252.1)具有98%的核苷酸同源性,覆盖率为100%,ORF1b区变异度最高,同源性为89.2%。HAstV-MLB2-YJMGK有三个开放阅读框(ORF1a,ORF1b和ORF2),ORF1ab编码非结构蛋白,ORF1a区域的一段免疫反应性表位分析表明该区域的碱基序列并未发生变化;ORF2编码衣壳蛋白。衣壳蛋白抗原预测显示,HAstV-MLB2-YJMGK抗原性并未发生变化。在两个患者的5个粪便样本中检测到HAstV-MLB2-YJMGK阳性,两个患者的第一份和最后一份样本之间间隔时间约为25天。HAstV的共同祖先出现的时间约为3800年前,近100年来HAstV的有效种群数量有所下降。HAstV种群历史贝叶斯线图表明,随着时间的推移,HAstV种群相对稳定,在过去的100年中,HAstV的遗传多样性已经下降。重组分析表明HAstV-MLB2-YJMGK毒株没有重组发生。我们利用高通量测序所得的衣壳蛋白的部分序列分析了 HAstV-MLB2-YJMGK的遗传多样性,在210bp序列中共发现81个变异位点,显示病毒在病人体内具有单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。衣壳区S、P亚区的非同义突变与同义突变(dN/dS)比值均为1.667,表明突变为正向突变。BEAST软件分析结果显示,HAstV的平均碱基替换率为 1.97×10-3/年,95%的 HPD 为 2.76× 10-4～5.77×10-4。研究结论我们分析了 allo-HSCT患者粪便中的病毒宏基因组学,显示这类病人标本中存在多种不同病毒的存在。HAstV-MLB2-YJMGK的衣壳蛋白抗原性和ORF1b区的免疫反应性均未发生变化,基因组ORF1b变异度较高,该区域编码RdRp蛋白,推测该病毒可能通过RdRp活性的改变和复制过程中调节作用的变化来影响自身复制增生。HAstV-MLB2-YJMGK与以前报道的HAstV-MLB2和灵长类AstV遗传距离较近,在进化树中形成一个独立的分支。HAstV共同祖先在3800年前,种群量一直保持相对稳定。近年来HAstV种群量在不断减少,可能是由于经济条件的改善和医疗水平的提高。HAstV-MLB2-YJMGK在免疫功能低下患者中较长时间持续存在,且准种中存在正向突变,提示这类病人可能是新型AstV 的来源库。