论文部分内容阅读
皮肤组织缺损在临床上十分常见,一般由各种急、慢性致伤因素,如机械损伤、烧伤、体表肿瘤切除、慢性溃疡等导致。创面愈合是在多种细胞及细胞因子共同参与下完成的复杂病理生理过程,主要涉及炎症反应、创面上皮化及收缩、胶原沉积及重塑这三个过程,而这三个过程是相互影响及相互调控的。严重创面愈合后往往胶原过度沉积,导致纤维化及疤痕形成,如何在促进创面愈合的同时减轻愈后纤维化程度一直是烧伤及各学科研究的热点,然而目前仍无理想结果。因此,探索新的促创面愈合、减轻愈后纤维化程度的途径,是急需解决的重大临床问题之一。micro RNA是一类短链非编码RNA,通过转录后水平调控蛋白表达来发挥功能,在创面愈合及纤维化疾病中发挥重要作用。mi R-203及mi R-210分别通过促进角质形成细胞迁移及增殖来促进创面愈合,而mi R-99及mi R-200家族则可抑制角质形成细胞迁移而延缓创面愈合。mi R-155早期研究主要集中在免疫领域,并发现mi R-155在炎性细胞发育及免疫反应调控中发挥重要作用,近期研究还发现mi R-155可以通过促进上皮间质转化而促进上皮细胞迁移。因此,我们猜测mi R-155可以通过促进角质形成细胞迁移而促进创面愈合,并可以通过调控创面炎性细胞功能而影响创面愈合后纤维化程度,在创面愈合及创面愈后纤维化中发挥重要作用。本研究拟通过创面局部注射mi R-155 plasmid及antagomir来调控创面局部mi R-155水平,在体内观察mi R-155在创面愈合及愈合后纤维化中的作用,以及体外细胞模型进行验证,并对其可能机制进行研究。方法:1、在SD大鼠背部造成1×1 cm全层皮肤缺损模型,创面局部注射mi R-155plasmid后观察其对创面愈合及上皮化速度的影响;成纤维细胞三维凝胶收缩实验及体内外α-SMA染色观察mi R-155 plasmid对创面收缩的影响。2、采用角质形成细胞划痕及Transwell细胞穿膜实验来观察mi R-155对角质形成细胞迁移的影响;采用Ki-67染色、MTT生长曲线测定及流式细胞周期检测的方法来观察mi R-155 plasmid对角质形成细胞增殖的影响。3、通过F-actin、E-cadherin、β-catenin、MMPs、TIMPs等与细胞迁移相关蛋白的检测来探讨mi R-155 plasmid促进角质形成细胞迁移的可能分子机制。4、SD大鼠创面病理染色观察mi R-155 plasmid对创面炎性细胞浸润数量的影响;通过愈后Ⅰ/Ⅲ胶原沉积水平检测来观察mi R-155 plasmid对创面愈后纤维化程度的影响。5、在C57小鼠背部全层皮肤缺损模型中注射mi R-155 antagomir并观察其对创面愈合速度影响;通过创面局部炎性细胞HE及免疫组化染色、炎性因子水平测定来观察创面局部注射mi R-155 antagomir对创面局部炎性细胞功能的影响。6、通过检测创面愈合后局部Ⅰ/Ⅲ胶原沉积量、Masson胶原染色来观察mi R-155antagomir局部注射对C57小鼠背部创面愈后纤维化程度的影响。结果:1、SD大鼠背部全层皮肤缺损模型中,创面局部注射mi R-155 plasmid能使创面局部mi R-155水平与对照组相比显著升高,并且创面愈合速度明显加快,病理染色显示mi R-155可以明显促进创面上皮化;mi R-155对成纤维细胞三维凝胶收缩、体内外成纤维细胞α-SMA蛋白表达均无明显影响。结果提示mi R-155可以通过加速创面上皮化而促进创面愈合,对创面收缩无明显影响。2、细胞划痕及Transwell细胞穿膜实验证实mi R-155可以促进角质形成细胞迁移;mi R-155对角质形成细胞Ki-67表达、生长曲线、细胞周期等都无明显影响。提示mi R-155在促进角质形成细胞迁移的同时对角质形成细胞增殖无明显影响。3、Western blot及免疫组化/荧光染色显示mi R-155对E-cadherin、β-catenin、F-actin、MMP-9等蛋白表达均无明显影响;mi R-155能引起MMP-2蛋白表达升高,并且MMP-2特异性抑制剂ARP101能部分抑制mi R-155诱导的角质形成细胞迁移增快,提示MMP-2在mi R-155诱导的角质形成细胞迁移增快及创面愈合加快中发挥重要作用,并且还有其他机制参与mi R-155诱导角质形成细胞迁移增快。4、SD大鼠皮肤缺损创面mi R-155 plasmid局部注射能增加创面中性粒细胞浸润数量,创面愈合后Ⅰ/Ⅲ胶原沉积量也明显增加。提示mi R-155能增强创面局部炎性细胞数量并导致愈后纤维化程度加剧。5、C57小鼠背部皮肤缺损创面mi R-155 antagomir局部注射能显著降低创面局部mi R-155水平,创面局部中性粒细胞及巨噬细胞浸润数量显著减少,同时促炎因子TNF-α、IL-β水平显著降低、抑炎因子IL-10水平显著增加;与对照组相比mi R-155antagomir局部注射对创面愈合速度无明显影响。结果提示创面局部低表达mi R-155可以调控创面炎性细胞功能但对创面愈合速度无明显影响。6、C57小鼠背部全层皮肤缺损创面mi R-155 antagomir局部注射愈合后Ⅰ/Ⅲ胶原、α-SMA蛋白表达显著降低,Masson胶原染色提示局部胶原排列更整齐、稀疏,表明mi R-155 antagomir可以减轻创面愈后纤维化程度,提高创面愈合质量。结论:创面局部高表达mi R-155能够通过促进角质形成细胞迁移加速创面上皮化而促进创面愈合,MMP-2在mi R-155所诱导角质形成细胞迁移增快中发挥重要作用,同时创面炎性细胞浸润数量增加,创面愈后纤维化程度加剧;创面局部低表达mi R-155能通过调控创面炎性细胞功能而减轻创面愈后纤维化程度,对创面愈合速度无明显影响。