多能性干细胞（Pluripotent stem cells,PSC）与早期胚胎的内细胞团或上胚层细胞一样都具有分化成外、中、内胚层细胞的多向分化潜能,因此能够用来在体外模拟不同细胞谱系分化发育的过程以及大量制备具有疾病模拟、药物筛选和临床治疗等用途的细胞。过去,科学家通过利用爪蟾、斑马鱼、鸡和小鼠等模式动物初步阐明了脊椎动物胚胎发育过程中不同细胞谱系建立的信号通路与基因调控的基本原理,类似的发育学研究在人中受到取材与伦理的双重限制而难以开展,但是,随着多能性干细胞及其定向分化技术的不断发展,研究人员意识到人多能性干细胞体外定向分化模型是一个能帮助研究不同细胞谱系分化发育过程中信号通路、基因表达以及表观遗传学调控规律的有力工具。鉴于此,本研究利用多能性干细胞定向分化模型解析了非受体酪氨酸激酶基因CSK参与调控胚胎干细胞向定型内胚层（Definitive endoderm,DE）以及胰腺前体细胞分化过程的作用机制。首先,本研究通过激活Wnt和Nodal/Activin信号通路成功将人胚胎干细胞分化为SOX17与CXCR4双阳性的定型内胚层细胞,分析鉴定了 CSK及其下游靶基因SFK（SRC family kinase,SFK）在胚胎干细胞向内胚层以及胰腺分化过程中的表达变化情况,利用CRISPR/Cas基因编辑技术敲除CSK确认其为定型内胚层分化过程中的负调控基因,CSK敲除的胚胎干细胞分化形成SOX17与CXCR4双阳性细胞的效率接近95%,比野生型干细胞提高了 30%,而且通过小分子化合物PP1抑制CSK的靶基因SFK几乎完全阻断CSK野生型和敲除型胚胎干细胞向定型内胚层细胞的分化过程,SFK抑制后逆转CSK敲除后的分化表型的结果与过去关于CSK通过磷酸化抑制SFK的结论相一致,表明了 SFK信号通路的激活是定型内胚层分化所必需的。然后,本研究通过ATAC-seq分析胚胎干细胞向定型内胚层分化过程中细胞基因组开放区域的动态变化规律,发现CSK野生型分化细胞存在大量受Hippo/YAP激活的开放基因组区域,而这些开放基因组区域在CSK敲除型分化细胞中很快被关闭,暗示CSK通过抑制Hippo/YAP通路促进定型内胚层细胞的分化,通过ROCK抑制剂Y27632阻碍YAP入核确实可以显著地提高CSK野生型胚胎干细胞的分化效率,与此相反,不论是CSK野生型还是敲除型胚胎干细胞,利用GPCR激动剂LPA促进YAP入核会极大地抑制它们形成定型内胚层的效率,证明CSK敲除导致的SFK激活对Hippo/YAP进行的有效抑制促进了胚胎干细胞向定型内胚层细胞谱系命运的转变。最后,为了进一步找到Hippo/YAP激活与抑制后下游关键的转录因子调控机制,本研究分别对多能性干细胞和定型内胚层细胞特异性表达的关键转录因子进行分析,发现YAP抑制后分化细胞中内胚层细胞特异性的转录因子EOMES、GATA6和SOX17迅速被激活,同时多能性因子OCT4的表达迅速被抑制,但是YAP激活后内胚层细胞特异性的转录因子EOMES、GATA6和SOX17的表达受到显著抑制,而多能性基因OCT4持续高表达,说明有效关闭多能性基因的表达对于完全激活定型内胚层细胞特异性转录因子调控网络具有重要的作用。鉴于ROCK抑制剂对Hippo/YAP通路的阻碍作用,本研究优化分化培养条件后显著提高了定型内胚层和胰腺前体细胞的分化效率,这将为完善人多能性干细胞体外分化技术提供新的思路。综上所述,本研究通过成功构建多能性干细胞体外定向分化模型揭示了 CSK基因在胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化过程中独特的信号通路、转录因子和染色质重塑的调控规律。