目的:以不同浓度羟基红花黄色素A(HSYA)干预体外培养子宫内膜异位症(Endometriosis, EMs)在位子宫内膜细胞。四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测HSYA对在位子宫内膜细胞的生长增殖的影响,酶联免疫吸附法(ELISA)测定HSYA对细胞培养上清液中细胞因子VEGF、bFGF分泌的影响。从而探讨HSYA治疗子宫内膜异位症的可行性。方法:1研究对象1.1实验组:选2009年10月—2010年1月在我院行腹腔镜或开腹手术治疗的EMs患者(术后病理证实均为增殖期),共15例(38.13±7.26岁)。1.2对照组:选择同期在我院因、纵隔子宫、畸胎瘤、单纯囊肿经腹腔镜检查无盆腔子宫内膜异位症(术后病理证实正常子宫内膜增殖期)者,共14例(34.92±8.11岁)。两组患者月经周期正常,近6个月无服用激素类药物及免疫抑制类药物史及IUD置入史。排除:子宫内膜息肉、急慢性盆腔炎、乳腺癌、子宫内膜癌等其它妇科恶性肿瘤;内分泌、免疫及代谢性疾病;高血压、心脏病、肾病等内科疾病等。采取标本均得到患者的同意,并签署了知情同意书。2标本采集刮取子宫内膜,立即置于冰浴的含青霉素和链霉素的1:1DMEM/F12培养基中,2小时内送实验室进行培养。3实验方法3.1细胞培养子宫内膜组织经漂洗、分离、消化、过滤。台盼兰染色,鉴定细胞活力。接种于含10%NBCS、青霉素及链霉素的FD的细胞培养瓶中,孵育24h换液,弃去未贴壁细胞及红细胞,继续培养,每隔48h换液一次,倒置显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。细胞长满80%瓶壁时,胰蛋白酶消化后,传代培养。细胞波形蛋白抗体及角蛋白抗体进行免疫化学细胞鉴定。3.2细胞生长测定3.2.1正常生长曲线取第2-3代细胞接种于96孔培养板,并设凋零孔。培养24、48、72、96、120、144小时后,每孔加入MTT、二甲基亚砜(DMSO),酶联免疫检测仪测定细胞吸光度值(OD值),绘制细胞生长曲线。3.2.2药物干预后细胞生长曲线取第2-3代细胞接种于96孔培养板,24h贴壁后加入不同浓度的GnRHa和HSYA ,每一浓度设5个复孔,并设空白组。培养24、48、72h后加MTT、DMSO,测定OD值,绘制细胞生长曲线。3.3 ELISA法测定细胞因子取第2-3代细胞接种于24孔培养板,含10%NBCS的FD培养24h,换含2%NBCS的FD继续培养24h,弃上清液,分别加入含不同浓度的GnRHa和HSYA的FD培养基,设立空白对照组,每组设3个复孔,48h后收集细胞培养上清液,于-20℃冻存待测, ELISA法测定VEGF及bFGF的含量。结果:1细胞生长情况EMs在位内膜细胞培养成功率为93.3%,正常子宫内膜细胞培养成功率为92.9%,细胞活力均在90%以上。2细胞鉴定①基质细胞Vimentin染色阳性,细胞胞浆呈棕黄色。②腺上皮细胞Cytokeratin染色阳性,细胞胞浆呈棕黄色。③阴性对照:PBS作为一抗,Vimentin及Cytokeratin染色均阴性。倒置显微镜下观察,子宫内膜细胞接种0.5h后即开始贴壁,24h后基本贴壁完全并开始生长。约2-4天细胞生长加快,以后生长减慢开始进入平台期。细胞紧密连接,排列较规则。3药物对离体细胞生长的影响3.1 HSYA对离体细胞生长的抑制作用药物作用24h后,细胞生长受到抑制,但无显著差异。药物作用48h、72h后,HSYA显著抑制细胞生长,呈剂量依赖性即HSYA浓度越大OD值越小(与细胞数成正比)。随着HSYA作用时间的延长及药物浓度的增加,对细胞的抑制作用逐渐增强。3.2 GnRHa对离体细胞生长的抑制作用药物作用24h后,细胞生长受到抑制,但无显著差异。药物作用48h、72h后,细胞生长受到显著抑制,呈剂量依赖性。随着GnRHa作用时间的延长及药物浓度的增加,对细胞的抑制作用逐渐增强。3.3 HSYA和GnRHa对离体细胞生长的抑制作用的比较药物作用24h后,两种药物对细胞有抑制作用但无明显差异。48h后HSYA 20、2、0.2μg/ml组分别与GnRHa10、1、0.1μg/ml组同级比较,GnRHa对细胞的抑制作用强于HSYA。HSYA 20μg/ml组比GnRHa 1μg/ml组抑制作用强,HSYA 2μg/ml组比GnRHa 0.1μg/ml组对细胞的抑制作用强。72h后HSYA 20、2、0.2μg/ml组分别与GnRHa10、1、0.1μg/ml组同级比较,GnRHa对细胞的抑制作用强于HSYA。HSYA 20μg/ml组与GnRHa 0.1μg/ml组抑制作用强。HSYA 2μg/ml组比GnRHa 0.01μg/ml组对细胞的抑制作用有统计学意义。4两种药物作用于正常子宫内膜细胞虽然有一定的抑制作用,但并没有统计学意义。5药物对细胞培养上清液中细胞因子表达的影响5.1 HSYA和GnRHa对细胞培养上清液中VEGF表达的抑制作用与不加药对照组比较,HSYA和GnRHa各浓度组均显著抑制VEGF的表达,呈剂量依赖性。两种药物抑制作用的比较,HSYA 20、0.2μg/ml组分别比GnRHa 0.1、0.01μg/ml组抑制作用强。因此虽然GnRHa对VEGF的抑制作用比HSYA强,但在一定范围内HSYA比GnRHa作用强。5.2 HSYA和GnRHa对细胞培养上清液中bFGF表达的抑制作用与不加药组比较,HSYA20、2μg/ml组和GnRHa10、1μg/ml组均显著抑制bFGF的表达,呈剂量依赖性。两种药物抑制作用的比较,HSYA 20、2μg/ml组对bFGF表达的抑制作用比GnRHa组10、1μg/ml组对bFGF强有统计学意义。由此可见,HSYA对bFGF的抑制作用比GnRHa强。结论:1子宫内膜细胞体外培养模型成功建立。2子宫内膜细胞分为间质细胞及腺上皮细胞两种。基质细胞中波形蛋白染色阳性,腺上皮细胞中角蛋白染色阳性。细胞悬液中基质细胞为单个细胞,圆形。腺上皮细胞为细胞团,类似葡萄串状。3细胞接种后约0.5小时开始贴壁,大约24小时细胞贴壁完成。2-4天细胞生长加快,第5天以后细胞生长进入平台期。4 HSYA及GnRHa均能显著抑制体外培养的EMs在位子宫内膜细胞的增殖,呈剂量-时间依赖性。同级比较GnRHa比HSYA抑制作用强,但在一定的浓度范围内HSYA比GnRHa对细胞的抑制作用强。5 HSYA及GnRHa对EMs在位内膜细胞体外培养上清液中细胞因子VEGF及bFGF的表达均具有抑制作用,呈剂量依赖性。GnRHa对VEGF的抑制作用强于HSYA,HSYA对bFGF的抑制作用强于GnRHa。6两种药物作用于正常子宫内膜细胞虽然有一定的抑制作用,但并没有统计学意义。HSYA对EMs离体在位子宫内膜细胞增殖的抑制作用可能是通过其对VEGF及bFGF表达的下调实现的。提示HSYA可能是治疗EMs的潜在药物,为子宫内膜异位症的治疗提供新的理论基础。