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第一部分PCOS大鼠模型的构建及HtrA3基因在PCOS大鼠卵巢颗粒细胞和血清中的表达目的:1、构建脱氢表雄酮(DHEA)诱导幼年雌性Wistar大鼠多囊卵巢综合征(PCOS)模型,并分析其胰岛素抵抗特征。2、检测PCOS大鼠颗粒细胞中HtrA3mRNA、血清及卵巢颗粒细胞上清液中HtrA3水平,探讨HtrA3基因在PCOS发病中所起的作用。方法:1、选取21日龄断奶的Wistar大鼠,随机分组为模型组和对照组,各20只,皮下注射DHEA建立大鼠PCOS模型:DHEA6mg/100g+0.2ml注射用油剂×20天,对照组大鼠在同时间皮下注射同体积的油剂。采用以下方法验证模型:全自动化学发光检测仪测定血清睾酮(T),雌二醇(E2),黄体生成素(LH);放射免疫学方法测定空腹血清胰岛素(FINS),血糖仪测定空腹血糖(FBG),并计算胰岛素抵抗指数(HOMA1-IR);卵巢称重并测定大鼠体重;卵巢组织切片,HE染色,并观察其病理变化。2、选择造模成功的PCOS组和正常对照组大鼠各20只,取出双侧卵巢,切片及提取颗粒细胞培养,收集颗粒细胞及上清液,并行心脏采血,留取血清。采用RT-PCR方法检测卵巢颗粒细胞中HtrA3mRNA的表达;用SABC免疫组织化学法检测卵巢组织切片中HtrA3蛋白的表达;采用ELISA法测定血清及颗粒细胞上清液中HtrA3浓度。结果:1、与对照组比较,PCOS模型组T,FBG,FINS,HOMA1-IR显著升高(P<0.05),两组大鼠体重变化无统计学差异(P>0.05),去除体重影响后PCOS模型组大鼠卵巢重量显著大于对照组(P<0.05)。卵巢切片HE染色显示:PCOS模型组卵巢有较多的囊状扩张卵泡,而黄体及发育阶段卵泡数目明显减少,颗粒细胞层数减少或消失。对照组可见多个黄体及不同发育阶段的卵泡。2、免疫组化结果提示HtrA3蛋白在大鼠卵巢各级卵泡中的卵母细胞和颗粒细胞中都有表达,PCOS模型组大鼠窦状卵泡中HtrA3蛋白表达显著降低(P<0.05);PCOS模型组大鼠卵巢颗粒细胞中HtrA3mRNA的表达显著低于对照组(P<0.01);PCOS模型组大鼠血清及颗粒细胞上清液中HtrA3水平表达显著低于对照组(P<0.05,P<0.01)。结论:1、DHEA诱导幼年雌性Wistar大鼠PCOS动物模型卵巢病理改变及血内分泌改变与PCOS病人相似,并存在胰岛素抵抗现象。2、HtrA3基因在大鼠卵巢各级卵泡卵母细胞和颗粒细胞的胞浆和胞核中都有表达。3、PCOS组大鼠颗粒细胞HtrA3mRNA、卵巢组织中HtrA3蛋白含量、血清及颗粒细胞上清液中HtrA3浓度均低于卵巢功能正常的大鼠,提示该基因可能与PCOS的发生及发展过程相关。第二部分PCOS大鼠HtrA3的表达与TGF-β1的相关性及其在PCOS中的意义目的:1、比较PCOS大鼠和卵巢功能正常大鼠血清及颗粒细胞上清液中HtrA3及TGF-β1水平的差异,探讨二者在PCOS发病中所起的作用。2、分析HtrA3及TGF-β1水平的相关性,探讨HtrA3可能参与PCOS发病过程的途径和机制。方法:ELISA法检测两组大鼠血清及颗粒细胞上清液中HtrA3及TGF-β1浓度并对检查结果进行相关性分析。结果:PCOS模型组大鼠血清及颗粒细胞上清液中HtrA3水平表达显著低于对照组大鼠(P<0.05,P<0.01)。PCOS模型组大鼠血清及颗粒细胞上清液中TG F-β1浓度显著高于对照组大鼠(P<0.01,P<0.05)。血清和颗粒细胞上清液中HtrA3水平与TGF-β1水平均呈负相关(分别为r= -0.4327, P<0.01和r= -0.3997, P<0.05)。结论: PCOS模型组大鼠血清及颗粒细胞上清液中HtrA3水平降低、TGF-β1浓度显著增高,二者表达水平呈负相关性。HtrA3参与PCOS的发病机制可能与TGF-β1的信号调节有关。