论文部分内容阅读
中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）,俗称河蟹,是我国重要的水产经济养殖动物。蜕壳是中华绒螯蟹乃至甲壳动物典型的生物学现象,直接决定着中华绒螯蟹的生长发育。蜕皮激素受体（Ecdysone receptor,EcR）是节肢动物蜕壳/蜕皮过程中的关键因子,是一种核受体,直接调控着蜕壳/蜕皮过程。EcR基因在昆虫纲动物蜕皮过程中的研究比较全面,然而中华绒螯蟹EcR基因的分子结构和其在蜕壳过程中的功能研究仍不深入。本研究利用分子生物学、细胞生物学、进化生物学、生物信息学等研究方法从四个层面开展了中华绒螯蟹EcR基因的研究:（1）EcR基因的分子结构和系统进化研究,（2）EcR选择性剪切异构体在中华绒螯蟹蜕壳和发育过程中的功能研究,（3）EcR对中华绒螯蟹蜕壳过程相关代谢通路的调控研究,（4）EcR-RXR转录调控复合物调控中华绒螯蟹蜕壳的功能研究。论文的主要结果和结论如下:1.中华绒螯蟹EcR基因的分子结构与系统进化中华绒螯蟹EcR（Ecdysone receptor,Es-EcR）蛋白的结构跟其它核受体类似,具有四个功能结构域,分别为A/B结构域、DNA结合结构域（C结构域）、D结构域和配体结合结构域（E结构域）。在本研究中,在前期实验室转录组数据的基础上,利用染色体步移的实验方法,获得了EcR基因的全长序列,EcR基因的全长为45,481bp,共包含9个外显子。通过分子克隆的方法,在中华绒螯蟹不同蜕壳时期的肝胰腺组织共鉴定出四个EcR基因的选择性剪切异构体,分别命名为Es-EcR-1,Es-EcR-2,Es-EcR-3和Es-EcR-4,其长度分别为:1,638 bp,1,626 bp,1,545 bp和1,638 bp。依据选择性剪切在基因组上发生的位置,中华绒螯蟹四个EcR选择性剪切的类型共存在5’端剪接类型（alternative 5’splice site）（Es-EcR-2）,5’端剪接和外显子跨越类型（exon skipping）（Es-EcR-3）,以及外显子跨越和内含子保留（intron retention）（Es-EcR-4）三种选择性剪切类型。利用序列比对和蛋白质三维结构预测的方法对EcR四个异构体进行功能区的预测,四个异构体在A/B和C结构域上是保守的,变异的区域主要发生在D和E结构域。其中Es-EcR-2缺失的12 bp以及Es-EcR-3缺失的12 bp和整个外显子都位于D结构域,Es-EcR-4内含子保留的区域位于E结构域,表明中华绒螯蟹EcR不同的异构体有不同的结构,可能具有不同的功能。通过对甲壳动物和对昆虫EcR基因异构体的变异区域分析发现昆虫纲动物选择性剪切的区域主要集中在A/B结构域,而甲壳动物主要集中D结构域和E结构域。利用最大似然法（ML）构建的系统进化树结果表明EcR基因在甲壳动物中聚为一枝,在昆虫中聚为一枝。EcR基因变异区域和系统进化树都表明甲壳动物和昆虫可能存在不同的进化压力。2.EcR选择性剪切异构体在中华绒螯蟹蜕壳和发育过程中的功能研究为了探究不同EcR异构体的生物学功能,进行了不同EcR异构体在中华绒螯蟹不同组织,不同蜕壳时期的肝胰腺以及卵巢不同发育时期EcR基因的时空表达研究。结果表明EcR基因的不同异构体在不同的发育过程中具有不同的表达模式。Es-EcR-2,Es-EcR-3,Es-EcR4在不同的蜕壳时期的肝胰腺中都有表达,其中Es-EcR-2和EsEcR-4在蜕壳前期、间期和后期的表达无显著变化,然而Es-EcR-3在蜕壳前期的表达量显著高于蜕壳间期和蜕壳后期（P<0.01）。Western blot结果也表明,Es-EcR-3的蛋白水平在蜕壳前期显著增加,与mRNA的表达水平一致。研究结果表明Es-EcR-3是调控中华绒螯蟹蜕壳的关键EcR异构体,在蜕壳过程中起重要的调控作用。利用siRNA干扰技术,成功的干扰了中华绒螯蟹Es-EcR-3异构体的表达,结果表明EsEcR-3干扰显著延长了中华绒螯蟹一个蜕壳周期的时长,进一步说明Es-EcR-3异构体在蜕壳过程中发挥着重要的作用。其它的EcR异构体在不同组织中也存在不同的表达模式,Es-EcR-2和Es-EcR-4在中华绒螯蟹的卵巢中表达量显著高于其它组织（肝胰腺除外）。Es-EcR-1在肝胰腺、眼柄和胃组织中表达量低,而在肌肉、心脏、胸神经节和精巢中相对高表达。Es-EcR-2异构体的表达量随着卵巢的发育逐步增加,在初级卵母细胞小生长期和初级卵母细胞大生长期明显高于卵原细胞时期,表明EsEcR-2在卵巢发育过程中发挥着重要的调控作用。3.Es-EcR-3干扰对中华绒螯蟹蜕壳过程相关代谢通路的调控为了探究Es-EcR-3基因如何启动和调控蜕壳相关的生物学过程,利用RNA干扰技术,在蜕壳前期成功干扰中华绒螯蟹Es-EcR-3基因的表达,然后将干扰组和对照组中华绒螯蟹的肝胰腺进行了转录组测序和比较分析。共鉴别了2,017个差异表达基因,与对照组相比,干扰组分别有1,124个基因下调和947个基因上调。对差异表达基因进行GO富集分析,结果表明干扰组低表达的基因主要富集在氧化还原反应和生殖调控相关过程,而高表达基因主要富集在类固醇激素介导的信号通路。Es-EcR-3的干扰,可能造成了氧化还原反应过程的受阻,从而引起了能量代谢过程的抑制,能量供给不充分从而引起了蜕壳间隔时长的增加这与研究内容2的结果一致。同时Es-EcR-3的干扰引起了生殖调控相关基因表达下调,说明Es-EcR-3也可能参与到了中华绒螯蟹性腺发育的调控过程中。而KEGG富集分析的结果表明,干扰组低表达的基因主要富集在昆虫激素合成通路,组氨酸代谢及由P450细胞色素酶代谢外源物的过程,而高表达的基因主要富集在与免疫相关的代谢通路上。干扰EcR导致昆虫类激素合成的相关基因表达降低,可能导致与蜕皮激素信号通路相关的激素的合成受阻,进而引起参与激素代谢的细胞色素P450相关基因表达也下降。4.EcR/RXR转录调控复合物启动中华绒螯蟹蜕壳的功能研究前期的研究结果表明昆虫在蜕皮过程中,EcR必须和RXR结合形成EcR/RXR转录调控复合物才能启动下游基因的表达,进而调控蜕皮过程。为了探讨中华绒螯蟹蜕壳过程中EcR和RXR的调控关系,本研究在前几章研究内容的基础上开展了EcR/RXR的转录调控活性研究。研究结果表明中华绒螯蟹的RXR存在6个选择性剪切异构体（Es-RXR-1至Es-RXR-6）,开放阅读框长度分别为:Es-RXR-1为1,350 bp,Es-RXR-2为1,299 bp,Es-RXR-3为1,236 bp,Es-RXR-4为1,200 bp,Es-RXR-5为870 bp,Es-RXR-6为915 bp。在中华绒螯蟹蜕壳周期过程中肝胰腺、表皮和肌肉组织中的RXR相对表达量在蜕壳前期并没有显著增加的趋势。进一步通过绝对定量检测,结果表达RXR在整个蜕壳周期过程中的表达比较恒定,且显著高于EcR基因的表达,在蜕壳后期RXR的表达量是EcR的269倍（肝胰腺）、209倍（表皮）和299倍（肌肉）,蜕壳前期这一比值分别降为8倍（肝胰腺）、42倍（表皮）和28倍（肌肉）。这一结果表明在蜕壳周期过程中,RXR基因的表达丰度高且稳定,为EcR/RXR转录调控复合物中的组成性成分,而EcR的表达量在蜕壳周期中表达波动很大且在蜕壳前期急剧上升（与上述EcR的研究结果一致）,是EcR/RXR转录调控复合物的形成过程中的限速因子,是中华绒螯蟹蜕壳过程中决定EcR/RXR转录调控活性启动的关键基因。为了进一步探讨EcR/RXR转录调控复合物在蜕壳过程中对下游基因的调控,本研究开展了EcR和RXR调控下游靶基因E75的双荧光素酶报告实验,研究结果表明,单独表达EcR或RXR时,下游基因E75的表达与对照组相比无明显的上调,而当EcR和RXR两者共同表达时E75的表达显著上调。表明EcR和RXR必须形成EcR/RXR转录调控复合物才能调控下游基因的表达,进而启动蜕壳过程。