风疹病毒是常见的上呼吸道感染病原体,也是常见的胎儿致畸的主要病原之一。风疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜,引起上呼吸道炎症。风疹病毒感染最严重的问题是孕妇感染可导致对婴儿的先天性损害,尤其前3个月感染风疹病毒,可通过胎盘感染胎儿,导致孕妇流产、死胎,或新生儿一系列的器官畸形等先天性风疹综合症。目前,风疹病毒实验室诊断越来越多地采用核酸扩增方法来检测临床标本中的风疹病毒RNA。但是,目前使用的以RT-PCR为主的RNA病毒核酸扩增检测试剂盒中,一般采用风疹病毒颗粒、裸露RNA或病毒RNA逆转录的cDNA作为阳性质控品或标准品。病毒颗粒和裸露RNA具有潜在的生物传染性,不稳定,易被RNase降解;cDNA不在病毒颗粒内,无法模拟临床标本中病毒核酸的提取及RNA逆转录过程,所以,风疹病毒颗粒、裸露RNA或病毒RNA逆转录的cDNA作为标准品或质控品,准确性都不理想。因而,人们普遍关心的是病毒核酸检测试剂盒中使用的阳性参考品和质控品是否具有传染性以及能否起到阳性全程监控的作用。提出假设:利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性,采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒,组装成内含风疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌体样颗粒,并将其作为阳性标准品应用于风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法中,并对其进行评价。实验目的:1.建立风疹病毒RNA TaqmMan实时荧光定量RT-PCR方法。2.利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性,采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒,组装成内含风疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌体样颗粒。3.将构建的风疹病毒RNA噬菌体样颗粒作为阳性标准品,应用于所建立的风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法中,并对其进行评价。实验第一部分:建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,将风疹病毒RNA逆转录cDNA作为RV实时荧光定量RT-PCR阳性标准品,定量检测已确诊的风疹患者咽拭子标本中风疹病毒RNA,评价其敏感度与特异度。实验第二部分:利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性,采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒。即将大肠杆菌MS2噬菌体衣壳蛋白的编码基因序列构建到原核表达载体pET30a(+)获一重组表达载体,然后将风疹病毒El的部分高度保守RNA序列构建到该重组表达载体上,经诱导后表达获内含风疹病毒El部分保守序列的噬菌体样颗粒,然后对内含风疹病毒El部分保守序列的噬菌体样颗粒进行定量分析,并验证其耐核糖核酸酶(RNase)特性,以及分析其在4℃和37℃血浆中的稳定性,并与风疹病毒病毒株在37℃血浆中的稳定性进行比较。实验第三部分:将实验第二部分构建的内含风疹病毒El部分保守序列的噬菌体样颗粒作为阳性标准品应用于实验第一部分所建立的风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法中,并定量检测已确诊的风疹患者鼻咽拭子标本中风疹病毒RNA,评价其敏感度与特异度。通过对其检测灵敏度、重复性、敏感度与特异度等指标的测定,并与实验第一部分中RNA逆转录cDNA作为阳性标准品时的相应指标进行比较,来分析实验第二部分构建的内含风疹病毒El部分保守序列的噬菌体样颗粒作为阳性标准品的优势所在。实验方法:1.建立风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,将风疹病毒RNA逆转录的cDNA,作为RV实时荧光定量RT-PCR阳性标准品,定量检测已确诊的风疹患者鼻咽拭子标本中风疹病毒RNA,评价其敏感度与特异度。2.利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性,采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒,采用基因工程方法构建含部分RV El、MS2衣壳蛋白及装配蛋白编码基因重组表达载体,经IPTG诱导表达获得含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒。3.行RT-PCR及PCR对噬菌体样颗粒包绕的内容物风疹病毒RNA进行验证。4.采用风疹病毒实时荧光定量RT-PCR方法对含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒进行定量分析。5.将噬菌体样颗粒悬浮液用TSM稀释液分别稀释10~7、10~8、10~9倍,对含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒每一个浓度实施RNase处理,采用实时荧光定量RT-PCR方法定量检测RNase处理前后的含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒,通过比较RNase处理前后的Ct值有没有显著性差别,来验证含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒耐核糖核酸酶(RNase)特性。6.将噬菌体样颗粒悬浮液,置于4℃和37℃EDTA抗凝正常人血浆中,分别孵育60天和30天,来验证含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒在4℃及37℃血浆中的稳定性;将含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液与RV病毒株,分别置于37℃EDTA抗凝正常人血浆中,孵育30天,采用实时荧光定量RT-PCR方法定量测定收集的几个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液与RV病毒株浓度,来比较噬菌体样颗粒与RV病毒株在37℃血浆中的稳定性。7.将含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒作为RV实时荧光定量RT-PCR阳性标准品,测定其检测灵敏度及方法的重复性,并定量检测已确诊的风疹患者鼻咽拭子标本中风疹病毒RNA,确定其敏感度与特异度。8.将含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒作为实时荧光定量RT-PCR阳性标准品时PCR扩增效率、方法的检测灵敏度、重复性、方法的敏感度与特异度,与风疹病毒逆转录cDNA作为实时荧光定量RT-PCR阳性标准品时的PCR扩增效率、方法的检测灵敏度、重复性、方法的敏感度与特异度进行比较。实验结果:1.成功建立了风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,采用风疹病毒逆转录cDNA作为阳性标准品,PCR扩增效率为1.89,方法的检测灵敏度为1.0×10~3copies/ml,方法的重复性结果为:对六个稀释度阳性标准品重复六次Ct值变异系数范围为3.2996～4.36%。以细胞培养法作为金标准,方法的特异度和敏感度分别为88.9%,81.3%。2.通过部分风疹病毒El保守序列测序验证,成功构建与表达含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒。3.将含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液进行10~4,10~5,10~6,10~7倍稀释,然后以各个稀释度为模板,分别行RT-PCR及PCR。RT-PCR扩增结果为阳性,PCR扩增结果为阴性,表明噬菌体样颗粒包绕的内容物为风疹病毒RNA,不是DNA,也不是DNA污染。4.将含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液进行10~4,10~5,10~6倍稀释,然后分别以各个稀释度为模板,采用风疹病毒实时荧光定量RT-PCR方法进行定量检测,含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液各个稀释度的浓度分别为2.05×10~5copies/μl,2.85×10~4 copies/μl,2.5×10~3 copies/μl。由此计算出含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液的原始浓度为2.45×10~9copies/μl。5.将噬菌体样颗粒悬浮液用TSM稀释液分别稀释10~7、10~8、10~9倍,浓度分别为2.45×10~5 copies/mL、2.45×10~4 copies/mL、2.45×10~3 copies/mL。含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒每一个浓度,RNase处理前后实时荧光定量RT-PCR方法定量检测Ct值没有显著性差别(P值均＞0.05)。表明RNase处理对含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒的浓度没有任何影响,也就表明含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒具有耐核糖核酸酶的特性。6.将浓度为2.45×10~4 copies/mL的噬菌体样颗粒悬浮液,置于4℃EDTA抗凝正常人血浆中,孵育60天,收集的每一个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液,采用实时荧光定量RT-PCR方法,对每一标本重复测定两次,取平均值。收集的八个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液所有标本测定值的变异系数为4.66%。表明含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液,在4℃EDTA抗凝正常人血浆中,至少持续保持稳定60天。7.将浓度为2.45×10~4 copies/mL的噬菌体样颗粒悬浮液,置于37℃EDTA抗凝正常人血浆中,孵育30天,收集的七个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液,采用实时荧光定量RT-PCR方法,对每一标本重复测定两次,取平均值。收集的七个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液所有标本测定值的变异系数为3.46%。表明含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液,在37℃EDTA抗凝正常人血浆中,至少持续保持稳定30天。8.分别将终浓度为2.45×10~3copies/μL、5.0×10~3copies/μL的噬菌体样颗粒悬浮液与风疹病毒株,置于37℃EDTA抗凝正常人血浆中,孵育30天,收集的每一个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液与风疹病毒株,采用实时荧光定量RT-PCR方法,对每一标本重复测定两次,取平均值。收集的六个时间点的噬菌体样颗粒悬浮液所有标本,平均值为2.54×10~3copies/μl,变异系数为4.11%。表明含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒悬浮液,在37℃EDTA抗凝正常人血浆中持续保持稳定30天。而收集的六个时间点的风疹病毒株所有标本测定的浓度范围为1.05×10~3copies/μl～5.0×10~3copies/μl,风疹病毒株于37℃血浆中孵育30天测得的结果(1.05×10~3copies/μl),与孵育0天所测结果(5.0×10~3copies/μl)相比,浓度下降了79%。9.采用风疹病毒噬菌体样颗粒作为风疹病毒RNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法的阳性标准品,PCR扩增效率为1.97,方法的检测灵敏度为2.45×10~2copies/ml,方法的重复性结果为:对六个稀释度阳性标准品重复六次Ct值变异系数范围为0.98%～1.03%。以细胞培养法作为金标准,该方法的特异度和敏感度分别为98.1%,91.1%。10.与风疹病毒逆转录cDNA作为阳性标准品相比,风疹病毒噬菌体样颗粒作为风疹病毒RNA Taqman实时荧光定量RT-PCR方法的阳性标准品,具有同样较高的PCR扩增效率(p＞0.05),具有更高的检测灵敏度(p＜0.05),具有更好的重复性(p＜0.001),具有更高的特异度(p＜0.01)和敏感度(p＜0.05)。实验结论:研究结果取得下列新的结论:1.实时荧光定量RT-PCR方法快速、敏感、特异。2.采用MS2噬菌体自我组装技术能够成功构建表达含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒。3.含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒耐核糖核酸酶。4.含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒在血浆中稳定性良好。5.与逆转录cDNA标准品相比,采用含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒作为标准品,实时荧光定量RT-PCR具有同样高的PCR扩增效率、更高的检测灵敏度和更好的重复性。6.与逆转录cDNA标准品相比,采用含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒作为标准品,实时荧光定量RT-PCR具有更高的特异度与敏感度。