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目的:胃癌是世界上发病率排名第五的癌症,并且胃癌的致死率在所有癌症中排名第三。尽管胃癌患者能从手术和放化疗中获益,但其5年生存率仅为40%左右,患者主要死于术后转移复发。由于尚缺乏可以早期发现胃癌的标志物,胃癌确诊时多已达中晚期,使得胃癌患者具有较高的病死率和较差的预后。因此寻找关键的标志物和有效的治疗靶点对于预防和治疗胃癌具有重要意义。纺锤体与动粒相关蛋白3(Spindle and kinetochore-related complex subunit 3,SKA3)是SKA家族的一员,SKA家族由SKA1,SKA2,SKA3组成。位于染色体13q12.11,在有丝分裂期间与NDC80复合物一起控制和调整有丝分裂。之前研究表明SKA3调控有丝分裂来影响肿瘤细胞的周期,现在发现其还能调控细胞的多种恶性表型及通路,从而促进癌症的进展,但在胃癌中尚未见其报道。双特异性磷酸酶2(Dual-specificity phosphatase 2,DUSP2)属于酪氨酸特异性磷酸酶家族,DUSP2已被证实不仅是免疫反应的重要调节者,而且在多种肿瘤如前列腺癌、肺癌、胶质瘤及白血病等中呈低表达,发挥抑癌基因的作用。并且DUSP2作为细胞外调节蛋白激酶(ERK)的上游基因,能使其去磷酸化进而失活,但DUSP2与胃癌进展的相关研究未见报道。SKA3已经证实在多种肿瘤中发挥癌基因的作用,但其机制尚未明确,我们在这个研究中通过免疫组化分析,明确SKA3能否作为胃癌的独立预后因素。并进一步研究SKA3功能及下游关键基因和信号通路,丰富SKA3作为癌基因在胃癌进展中的机制,为以后靶向药物的研制提供临床证据。方法:1、首先我们分析TCGA,GEO胃癌数据库中癌和癌旁组织中SKA3mRNA表达差异情况。进一步选取2018年中国医科大学新鲜冻存胃癌及癌旁组织35例行实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot检测SKA3的表达水平。取2009-2012年于本中心确诊为胃癌的组织标本164例,采用免疫组化法检测SKA3蛋白的表达水平。采用卡方检验分析SKA3表达情况与临床病理特征的关系,Pearson检验分析SKA3和DUSP2表达的相关性。Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析患者生存数据。2、采用qRT-PCR,Western blot检测胃癌细胞株MKN-45,SGC‐7901,MGC‐803,HGC-27及GES-1中的表达情况,选择高表达的两株为稳定敲除SKA3的细胞系。通过体外CCK-8实验,克隆形成实验,流式细胞术,划痕实验,Transwell迁移侵袭实验,粘附实验,研究SKA3对胃癌增殖,迁移,侵袭,粘附,EMT的影响。3、体内实验通过裸鼠成瘤模型,观察SKA3对肿瘤增殖能力的影响。4、为了研究SKA3促进胃癌进展的机制,我们选择MGC‐803沉默组和对照组进行了RNA-seq,我们筛选出下游关键基因(DUSP2)及其富集的通路(MAPK/ERK),并进一步研究DUSP2的功能及通路指标的变化。5、我们通过挽救实验验证恢复DUSP2对SKA3功能的变化,进一步验证SKA3对DUSP2的调控作用。结果:1、我们通过分析TCGA,GEO胃癌数据库中SKA3 mRNA表达水平,发现SKA3在各个数据库的癌组织中都高表达。通过我们中心收集的35对胃癌和对应的癌旁组织进行qRT-PCR及Western blot检测,结果显示SKA3在胃癌组织中相对于癌旁组织表达上调。通过对164例胃癌组织行免疫组化,发现SKA3,DUSP2蛋白主要在细胞质和细胞核中表达。其中SKA3,DUSP2阳性表达率分别为52.44%(86/164),45.12%(74/164)。胃癌组织SKA3表达与DUSP2表达呈负相关(Pearson检验,r=﹣0.535;P<0.001)。SKA3与临床病理因素的关系中显示,SKA3高表达与Borrmann分型、N分期、腹膜转移显著相关,P值均<0.05。Kaplan-Meier分析显示高表达SKA3和DUSP2低表达的患者与较短的总体生存(Overall survival,OS)相关。在COX多因素分析进一步证实了Borrmann分型、T分期、N分期、腹膜转移和SKA3高表达是一个独立的OS预后因素(HR=1.829,95%CI:1.187-2.818,P=0.005;HR=1.950,95%CI:1.028-3.702,P=0.028;HR=2.768,95%CI:1.471-5.209,P=0.001;HR=2.210,95%CI:1.125-4.342,P=0.021;HR=1.542,95%CI:1.003-2.372,P=0.049)。2、采用qRT-PCR,Western blot检测胃癌细胞株MKN-45,SGC‐7901,MGC‐803,HGC-27及GES-1中SKA3的表达情况,相对于GES-1,其他胃癌细胞系中SKA3皆高表达,并且SKA3在MGC‐803,HGC-27中表达相对较高,选择作为稳定敲除SKA3的细胞系。CCK-8细胞增殖实验显示SKA3沉默组细胞的活性明显低于其对照组。细胞克隆形成实验显示沉默组细胞克隆数少于对照组。流式细胞术显示沉默组周期明显阻滞在G0/G1期。Transwell迁移及侵袭实验显示沉默SKA3表达对胃癌细胞的迁移和侵袭也有明显的抑制作用,我们通过免疫组化分析发现,SKA3高表达与腹膜转移相关,我们通过粘附实验发现,沉默组胃癌细胞粘附于间皮细胞的数目明显少于对照组,说明SKA3低表达抑制了胃癌细胞粘附腹膜的能力,使之不容易发生腹膜转移。Western blot表明沉默SKA3可通过上调E-cadherin和下调N-cadherin和Vimentin来抑制EMT,并且沉默SKA3组磷酸化ERK1/2(Thr202/Tyr204)表达下调,总体ERK1/2无变化,说明SKA3通过磷酸化ERK1/2激活MAPK/ERK通路。3、我们建立裸鼠皮下成瘤模型,4周处死小鼠发现SKA3沉默组相对于阴性对照组肿瘤增殖受限,且肿瘤体积,重量均小于对照组。体内实验结果证明SKA3低表达抑制了胃癌的增殖。4、构建稳定过表达DUSP2的细胞系。CCK-8细胞增殖实验显示过表达组细胞活性明显低于其对照组。细胞克隆形成实验显示过表达组细胞克隆数少于对照组。流式细胞仪检测显示,过表达组周期阻滞在G0/G1期及S期。Transwell迁移及侵袭实验显示DUSP2过表达对胃癌细胞的迁移和侵袭也有明显的抑制作用。我们通过粘附实验发现,过表达组胃癌细胞粘附于间皮细胞的数目明显少于对照组,说明DUSP2高表达抑制了胃癌细胞的粘附能力,使之不容易发生腹膜转移。Western blot表明过表达DUSP2可通过上调E-cadherin和下调N-cadherin和Vimentin来抑制EMT。过表达DUSP2组相对于对照组磷酸化ERK1/2表达下调,总体ERK1/2无变化。5、为了进一步验证SKA3调控DUSP2及ERK1/2这一信号轴发挥功能,我们在之前敲除SKA3的基础上敲除DUSP2行挽救实验,功能挽救实验发现,敲除DUSP2后相对于单一敲除SKA3组部分增加了细胞的增殖、迁移、侵袭、粘附能力。通过Western blot显示,敲除DUSP2后相对于单一敲除SKA3组SKA3、N-cadherin、Vimentin、磷酸化ERK1/2表达被部分增加,E-cadherin表达部分减少,而总体ERK1/2无变化。我们的研究表明SKA3通过负向调控DUSP2,激活MAPK/ERK通路,来影响胃癌的恶性表型。结论:我们免疫组化研究发现高表达的SKA3与DUSP2表达呈负相关,且与N分期,腹膜转移,较差的预后相关。体外研究表明低表达的SKA3以及高表达的DUSP2抑制了胃癌的增殖,迁移,侵袭,粘附,EMT。体内实验证明低表达SKA3抑制胃癌的增殖。机制上我们发现SKA3负向调控抑癌基因DUSP2发挥促癌功能,并且DUSP2使ERK1/2去磷酸化并使其失活。至此,我们的研究证实SKA3-DUSP2-ERK1/2轴是胃癌的潜在的治疗靶标。