论文部分内容阅读
特络细胞(Telocytes,TCs)是近年来新发现的一种间质细胞,已被证实存在于女性子宫、子宫内膜、输卵管、卵巢等组织内。目前越来越多的报道表明特络细胞可能参与某些临床疾病的发生与发展,特别是与纤维化相关的疾病。在我们之前的研究中发现特络细胞可以对腹腔巨噬细胞的免疫功能产生调节,我们猜测特络细胞可能因此对腹腔微环境有影响,因而对子宫内膜异位症的发生和发展有一定的作用。在我们进一步的研究过程当中,发现特络细胞可以直接激活子宫内膜间质细胞(ESCs)。可能可以直接影响子宫内膜疾病的发生与发展。本实验研究在体外培养的条件下,直接和间接共培养ECSs与TCs,观察TCs处理后的ESCs发生的形态、活力、运动功能、黏附能力、细胞周期、凋亡和通路蛋白表达的变化,目的是了解子宫特络细胞对子宫内膜间质细胞的影响及其潜在机制。它为理解和治疗子宫内膜相关疾病发展提供了新的方向。方法:1.水合氯醛(2ml/只)肌肉注射处死雌小鼠,取出小鼠子宫,胶原酶消化,提取原代特络细胞,进行细胞培养;2.将发情期的雌雄鼠按2:1的比例合笼培养,观察阴道栓情况判断交配情况,记录为孕第一天,选取孕4天小鼠处死后,分离子宫组织,通过搔刮+酶消化法提取ESCs,进行原代子宫内膜间质细胞培养;3.采用相差显微镜,结晶紫染色,免疫荧光等方法鉴定特络细胞,观察其特殊的细胞结构;4.在培养的前4-5天,连续观察细胞变化,并在每天早中晚在相差显微镜下拍摄照片,记录细胞的形态变化(典型结构是特络细胞的胞体出现极细长串珠状突起);5.稳定生长的特络细胞出现典型细胞结构后,用无血清培养基换液,在培养箱中培养24小时后,收集上清液,即收获了特络细胞条件培养基(TCM);6.同样采用倒置相差显微镜,结晶紫染色,免疫荧光染色(vimentin,pan Cytokeratin(PCK))等方法鉴定并观察子宫内膜间质细胞的细胞形态及纯度;7.ESCs传代并生长稳定后,与TCs进行直接共培养,动态观察并记录ESCs的变化情况;8.ESCs传代后稳定生长,将其与TCs(实验组)和空白培养基(对照组)利用和transwell小室分别进行间接共培养,培养后的ESCs分别称之为TCs-educated ESCs 和 Non-educated ESCs;9.观察并记录Oh、24h、48h的直接共培养后ESCs镜下形态转变情况;检测间接共培养24h后,ESCs细胞活力、黏附功能、迁移侵袭、细胞周期、凋亡和细胞胞内通路蛋白激活情况的改变。探讨ESCs在TCs的作用下,发生的形态和功能的改变以及可能的机制;结果:1.在倒置相差显微镜下,观察到原代培养3-4天后,小鼠子宫特络细胞出现典型的形态特征。表现为胞体较小,胞体出现一个或数个突起(Tps),该突起极为细长且呈表现为粗细交替样。2.荧光染色后,小鼠子宫特络细胞表现为Vimentin和CD34双阳性,c-kit阴性。细胞纯度为大于95%。3.显微镜下观察到原代ESCs多呈长梭形或多角形,较扁平,极易铺展开生长,平行排列,铺展开后外形轮廓分界不清,核不明显;小鼠子宫内膜上皮细胞多为多边形,呈片状生长,易与间质细胞进行区分;使用波形蛋白和角蛋白进行免疫荧光染色,ESCs表现为波形蛋白阳性且角蛋白阴性,细胞纯度为大于 95%。4.直接共培养动态观察发现,TCs与ESCs之间随着时间变化逐渐产生连接,该连接可存在与胞体与TPs间也可存在于胞体与胞体之间。5.CCK-8 法分别检测 TCM-educated ESCs 和 Non-educated ESCs 两组的子宫内膜间质细胞的细胞活力,结果显示:实验组(TCM-educated ESCs)细胞活力较对照组(Non-educated ESCs)明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。6.基质胶黏附实验分别检测TCs-educated ESCs和Non-educated ESCs两组的子宫内膜间质细胞的黏附能力,结果显示:实验组(TCs-educated ESCs)细胞黏附能力较对照组(Non-educated ESCs)明显增强,差异具有统计学意义(p<0.05)。7.Transwell 小室分别检测 TCs-educated ESCs 和 Non-educated ESCs 两组的子宫内膜间质细胞的细胞迁移和侵袭,结果显示:实验组(TCs-educated ESCs)细胞的运动功能较对照组(Non-educated ESCs)明显增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。8.流式细胞仪检测TCs-educated ESCs和Non-educated ESCs两组细胞周期与凋亡,结果显示:实验组(TCs-educated ESCs)细胞黏附能力较对照组(Non-educated ESCs)G2/M 比例显著增加,差异具有统计学意义(p<0.05);两组细胞凋亡率差异不具有统计学意义(p>0.05)。9.Western bolt 检测 TCs-educated ESCs 和 Non-educated ESCs 两组的子宫内膜间质细胞的胞内蛋白表达情况,结果显示:实验组P-ERK/ERK的比值和cyclin-D3含量均高于对照组。差异具有统计学意义(p>0.05);比较两组间P-AKT/AKT的比值,差异不具有统计学意义(p<0.05)。结论:TCs处理后的ESCs表现出明显的活化状态,细胞活力显著提高,同时黏附功能和运动能力也明显增强,ERK途径被激活。猜测子宫特络细胞可能对子宫内膜间质细胞起到某种活化作用,这种作用可能在子宫内膜相关的疾病中产生影响。这一实验结果加深了特络细胞在妇产科疾病中的认识,并为其应用于子宫内膜相关疾病的发生、发展和治疗提供可能。