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目的：卵巢表面上皮细胞(Ovarian Surface Epithelial Cell, OSEC)是包被卵巢表面的单层立方-长方形上皮细胞。由于卵巢定期排卵的生理功能，需要上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)的正常生物学特性参与卵巢表面上皮的修复。而且近年的研究发现，在卵巢表面以及与输卵管交接的卵巢门区域也存在成体干细胞/肿瘤干细胞(Stem cell, SC/Cancer Stem Cell, CSC)，参与卵巢表面上皮的生理性修复。目前认为90%的卵巢癌起源于OSEC。因此，本研究提出“EMT和干细胞/肿瘤干细胞特性获得可能参与卵巢表面上皮细胞的自发恶性转化”这一科学假说，通过小鼠卵巢表面上皮细胞(Mouse Ovarian SurfaceEpithelial Cell, MOSEC)自发性恶性转化模型的建立，观察EMT及干细胞/肿瘤干细胞特性在MOSEC恶性转化过程中的改变，研究MOSEC自发恶性转化的可能机制，初步探究OSEC起源的上皮性卵巢癌发生早期相关分子事件，为上皮性卵巢癌的防治提供基础研究资料。方法：本研究分为三个部分。(1) MOSEC自发性恶性转化模型的建立：分离未生育过的雌性BALB/C小鼠的卵巢表面上皮细胞，以上皮细胞标志物Pan-keratin鉴定MOSEC的纯度。在MOSEC体外连续传代培养过程中，使用生长曲线、平板克隆形成及软琼脂克隆形成等实验检测细胞增殖能力，结合恶性转化灶出现的细胞形态和染色体数目的变化，分析MOSEC的体外恶性转化能力，通过裸鼠体内成瘤实验证实MOSEC发生自发恶性转化。(2) MOSEC自发恶性转化过程中EMT的作用：使用RT2Profiler PCR Array Mouse EMT试剂盒检测EMT相关基因在不同阶段MOSEC表达水平的变化，以E-cadherin和Pan-keratin为上皮细胞标志物，Vimentin、Snail、Slug及β-catenin为间质细胞标志物，采用免疫荧光方法定性定位，以及Western Blotting定量分析MOSEC恶性转化不同时期EMT相关蛋白表达水平的变化。(3) MOSEC自发恶性转化过程中肿瘤干细胞样特性的变化：以CD44、CD117、CD133、Nanog及Oct-4为干细胞/肿瘤干细胞标志物，采用免疫荧光方法定性定位分析恶性转化不同时期上述标志物的变化，流式细胞仪定量检测CD44+/CD117+细胞在恶性转化不同时期的变化；通过悬浮球细胞形成实验及限制稀释实验检测各阶段MOSEC的自我更新能力；使用无mEGF和mbFGF生长因子，但是含10%FBS的DMEM/F12培养基培养悬浮球细胞，观察其分化能力；最后观察悬浮球细胞在裸鼠体内的致瘤能力。结果：(1) MOSEC自发性恶性转化模型的建立：根据细胞形态、细胞增殖能力和染色体数目的变化，把体外连续传代培养的MOSEC分为早期(MOSEC in Early,M-E, P4-P15)、中期(MOSEC in Intermediate, M-I, P20-P85)和晚期(MOSEC inLate, M-L,>P90)三个阶段。本实验分离的MOSEC纯度达90%以上，并且可以在体外长期连续传代培养，其中，早期的P10-P15为“艰难期”。随着细胞传代次数的增加，细胞形态由“经典鹅卵石形”变为“纺锤梭形”，克隆形态由“闭合岛形”到“半闭合岛形”最后呈“开放岛形”，说明MOSEC细胞连接减弱，运动能力提高。晚期MOSEC出现恶性转化灶。生长曲线的实验结果表明，传代次数大于40代的中期和晚期MOSEC增殖速度明显加快，尤其是晚期MOSEC生长曲线更加陡峭。早期、中期和晚期MOSEC的平板克隆形成率分别为0、3.83%(P<0.01)及36.00%(P<0.01)；软琼脂克隆形成率分别为0%、0.02%及1.35%(P<0.05)；平均染色体数目分别为49、58及64，晚期MOSEC超四倍体细胞比例增高；裸鼠成瘤率分别为0、0及80%。以上细胞形态变化、细胞增殖实验、染色体数目分析和裸鼠成瘤实验结果均表明，随着细胞体外传代次数的增加，小鼠卵巢表面上皮细胞的增殖能力逐渐增强，至晚期发生了明显地自发性恶性转化。(2) MOSEC自发恶性转化过程中EMT的作用：体外长期连续培养过程中，MOSEC由上皮细胞的“鹅卵石形”转化成间质细胞样的“纺锤梭形”，并且上皮细胞标志物Pan-keratin及间质细胞标志物Vimentin持续表达，说明MOSEC是一种既表达上皮细胞标志物又表达间质细胞标志物的“双性细胞”；PCR Array的实验结果表明，在MOSEC恶性转化过程中，促进EMT过程的Cav2、Cald1、Wnt11和Snail等基因表达水平增加，而EMT过程中下调的基因Krt19和Tspan13的表达也相应减少；免疫荧光和Western Blotting的实验结果表明，随着细胞传代次数的增加，Snail和Slug表达量也提高，至晚期达最高，E-cadherin和β-catenin在中期表达水平最高，晚期MOSEC中β-catenin表达略有下调，但仍高于早期阶段。说明MOSEC自发恶性转化过程伴随着EMT，并且促进EMT过程的转录因子Snail和Slug表达量与MOSEC的恶性转化程度一致；(3) MOSEC自发恶性转化过程中肿瘤干细胞样特性的变化：干细胞/肿瘤干细胞标志物CD44、CD117、CD133及Oct-4在早期MOSEC中就表达，随着细胞传代次数增加，CD44和CD117阳性表达率逐渐提高，Nanog阳性表达也出现；早期、中期和晚期MOSEC悬浮球形细胞形成率分别为0%、0.14%和0.69%(P<0.05)，并且发现第五代悬浮球形细胞的悬浮球形成率明显高于晚期MOSEC(P<0.01)。限制稀释实验提示晚期MOSEC需要96.30个细胞可形成一个肿瘤细胞球；晚期MOSEC形成的悬浮细胞球在血清诱导下可以贴壁生长，提示其具有干细胞特性即分化能力；与晚期MOSEC相比，其形成的悬浮球细胞接种于裸鼠后提前2周出现肿块，并且发现悬浮球细胞形成的肿瘤组织CD44阳性细胞数也明显多于晚期MOSEC。以上实验结果表明，早期MOSEC即存在干细胞/肿瘤干细胞，随着MOSEC体外传代次数的增加，干细胞样细胞比例增加，MOSEC自我更新能力增强，在血清的诱导下也具有分化能力，说明干细胞/肿瘤干细胞特性的获得参与了MOSEC自发恶性转化的过程。结论：1.本实验分离的小鼠卵巢表面上皮细胞纯度达90%以上，并且在体外长期连续培养的过程中，可以自发性恶性转化；2. EMT参与小鼠卵巢表面上皮细胞的自发性恶性转化过程，这与它是一种既表达上皮细胞标志物又表达间质细胞标志物的“双性细胞”有关，并且促进EMT过程的转录因子Snail和Slug表达量与小鼠卵巢表面上皮细胞的自发性恶性转化的程度一致；3.干细胞/肿瘤干细胞样细胞特性获得参与小鼠卵巢表面上皮细胞的自发性恶性转化过程，这与它早期即表达CD44、CD117、CD133和Oct-4等干细胞/肿瘤干细胞标志物有关，并且干细胞样细胞比例增加和自我更新能力增强与小鼠卵巢表面上皮细胞自发性恶性转化程度一致。