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鹿茸是除驯鹿以外,大部分雄性鹿科动物的第二性征,着生于额骨的顶部,是鹿科动物头部的骨质附属器官。鹿茸是一种名贵中药材,在中国已应用了2000多年,具有增强机体免疫力、抗衰老、加速创伤愈合、促进骨质修复等功效；鹿茸是哺乳动物中唯一可以完全再生的哺乳器官,其生长速度极快,可以作为研究哺乳动物器官再生及创伤修复的理想模型。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是促进鹿茸生长的重要细胞生长因子,主要通过与其受体IGF-1R结合发挥生物学作用。MicroRNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性具有调控功能的非编码RNA。miRNA主要通过与靶基因的3’端非编码区(UTR)序列互补配对结合,对靶基因的表达起抑制作用。本课题从RNA组学角度,探讨miRNA介导的IGF-1R基因沉默对鹿茸软骨细胞增殖抑制的影响,为研究IGF-1R对鹿茸快速生长发育的作用奠定理论和实验基础。从更深层次上为阐明鹿茸再生的分子调控机理提供新的思路。本实验分段克隆梅花鹿IGF-1R基因部分序列,将测序正确的部分序列拼接成完整的编码区全序列；应用荧光定量PCR技术检测IGF-1R在鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层、前层软骨层及软骨层的表达水平；制备鹿茸顶端软骨和间充质组织的miRNA芯片,并进行miRNA差异表达分析；人工合成IGF-1R3’UTR部分序列,应用TargetScan生物信息学软件并结合miRNA芯片结果,筛选出能与IGF-1R3’UTR结合并发挥功能的miRNA;构建双荧光素酶报告基因载体,检测荧光素酶的相对活性,验证IGF-1R的miRNA结合位点；qPCR技术检测1miRNA mimics转染细胞后的miRNA稳定性及表达量;MTT法和流式细胞仪检测鹿茸软骨细胞的增殖情况及细胞周期的变化;Western blotting检测转染miRNA后,软骨细胞中IGF-1R的蛋白表达水平的变化。实验结果表明：克隆获得IGF-1R的编码区序列全长为4104bp,与牛、猪、人、鼠的核苷酸序列的同源性分别为97.51%、93.15%、91.08%、87.37%,氨基酸序列的同源性分别为99.05%、98.39%、97.51%、95.18%；IGF-1R在鹿茸顶端组织各部位的表达水平存在明显差异,其中软骨层表达量最高,前层软骨层、茸皮层、间充质层表达量依次降低。梅花鹿鹿茸软骨与间充质组织miRNA的芯片制备结果显示：芯片各项检测参数符合质控要求,芯片制备成功。以牛的miRNA为探针,通过跨物种miRNA探针杂交检测发现,鹿茸顶端间充质层存在的miRNA为289条,软骨层存在的miRNA为304条,两部位的miRNA存在差异性表达,在间充质中筛选出上调表达的miRNA为117条,下调表达的miRNA为71条；而在软骨中筛选出上调表达miRNA为97条,下调miRNA为87条；两部位中共同存在且显著差异性表达的miRNA为158条。双荧光素酶相对活性检测结果发现：let-7a、let-7f可以与IGF-1R3’UTR结合,IGF-1R是let-7a、let-7f的靶基因；qPCR检测结果进一步验证let-7a、let-7f mimics转染鹿茸软骨细胞24h、48h、72h后,与对照组比较,表达量明显提高；MTT法检测细胞增殖和流式细胞仪检测细胞周期的结果表明：let-7a、let-7f mimics对鹿茸软骨细胞的增殖具有抑制作用；转染let-7a、let-7f inhibitor后,细胞的增殖速度加快,表明inhibitor能够竞争性的结合细胞内源性的1niRNA,从而使miRNA抑制细胞增殖的作用减弱；而let-7a、let-7f使G0/G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比下降,细胞被阻滞在G0/G1期；Western blotting结果提示：与对照组相比,细胞转染let-7a、let-7f mimics24h、48h、72h后,IGF-1R的表达水平降低；转染let-7a、let-7f inhibitor24h、48h、72h后,IGF-1R的表达水平提高。