研究背景与内容鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一。它的发生是一个多基因、多阶段、多途径的进程,对鼻咽癌相关新基因的研究仍将有助于我们更好的揭示鼻咽癌的发病机理。本研究在所在课题组前期研究的基础上,采用基因芯片技术,结合前期实验的结果,筛选出了细胞周期依赖性激酶CDK6作为本次研究的对象,并观察到了其细胞周期信号通路的异常表现。基于以上研究结果,本研究为了明确CDK6在鼻咽癌中的作用,了解其参与了哪些miRNA的表达和调控途径,开展以下研究。研究内容与方法1.采用免疫组化和荧光定量等方法检测CDK6在鼻咽癌组织和细胞系中的表达水平,并结合临床资料进行统计学分析。2.利用瞬时转染法沉默CDK6基因在鼻咽癌细胞中的表达,通过MTT、tranwell、boyden等手段研究其对于鼻咽癌细胞生物学特性的影响。3.对干扰CDK6表达的鼻咽癌细胞进行miRNA芯片表达谱的分析,并通过MTT、tranwell、boyden、药敏试验等手段对筛选出的目标miRNA进行功能和机制学的研究。结果1.免疫组化结果显示,CDK6在鼻咽癌组织和细胞系中,均以高表达为主,与正常鼻咽上皮组织以及细胞系相比,差异有统计学意义(P<0.001)。PCR验证后的结果相同。同时,有CDK6的核表达的患者的总生存率较无CDK6的核表达的患者更差。2.沉默CDK6基因对鼻咽癌细胞生物学行为的影响采用瞬时转染法,感染HONE1和5-8F细胞,western blot验证其感染效率明确,用于后续实验。1)采用MTT法检测CDK6基因沉默后细胞的体外增殖情况,结果显示,与空白对照组相比,实验组细胞的增殖速度显著减慢,结果具有统计学意义。2)Transwell小室检测CDK6沉默后鼻咽癌细胞体外迁徙运动能力的变化,结果显示,与空白对照组相比,干扰CDK6后的细胞运动能力明显减弱。3)Boyden小室检测CDK6基因沉默后鼻咽癌细胞体外侵袭运动能力的改变,结果显示干扰CDK6后,鼻咽癌细胞的侵袭能力显著降低。3.沉默CDK6表达后,利用miRNA芯片进行表达谱分析及机制、功能验证。沉默CDK6表达后,利用miRNA表达谱芯片筛选出表达差异最显著的Let-7d做为下一步研究对象。1)采用Let-7dmimics/inhibitor转染后,MTT法检测增殖情况,与空载对照组相比,Let-7d mimics组细胞生长速度明显降低(P<0.001),Let-7d inhibitor组细胞生长速度明显增快(P<0.001),结果有统计学意义。2)Transwell小室迁移实验,相比于对照,Let-7d mimics组细胞穿膜的数量减少,Let-7d inhibitor组细胞穿膜的数量增加,差异有统计学意义(Mimics t=7.572,P<0.001,Inhibitor t=5.494,P<0.001)。3)Boyden小室侵袭实验,相比于对照组,Let-7d mimics组细胞穿膜数量减少,Let-7dinhibitor组细胞穿膜数量增加,差异有统计学意义。4)western blot检测,Let-7d mimics 转染细胞后细胞周期基因c-myc表达下调。反之,Let-7d inhibitor组中,则c-myc表达上调。5)采用MTT法对CDK6以及let-7d表达改变导致鼻咽癌细胞对(5-fu)药物敏感性的影响进行了检测。观察到let-7d能够增高NPC细胞对5-Fu的药物敏感性。结论:1.CDK6在鼻咽癌组织中较正常鼻咽组织表达明显上调,其核表达阳性与患者生存率明显相关;2.CDK6基因能够增强鼻咽癌细胞的体外增殖能力,并促进其迁移和侵袭,对鼻咽癌的发生其正向调节作用。3.CDK6可能与miRNA中的let-7d存在负相关性,并通过鼻咽癌相关蛋白c-myc调节let-7d的表达,两者之间可能存在负性反馈环路。