古菌来源海藻糖合成关键酶类的克隆、表达及性质研究

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海藻糖是一种重要的非还原性双糖,该糖在生物体内具有抗干旱、抗高温、抗碱和抗渗透压的作用,并广泛应用于食品、农业和生物技术领域。目前常用发酵法、合成法、酶转化法以及基因工程法来生产制备海藻糖。而酶法生产又是研究的热点之一。  本研究主要内容包括:⑴古菌来源的某些海藻糖代谢酶类具有耐高温、抗酸碱、提高反应速率等优良性质,具有大规模工业生产海藻糖的研究价值。因此继续发掘、利用其他微生物尤其是古菌来源的海藻糖代谢酶类具有重要意义。在本文中,针对嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain7来源的麦芽寡糖基海藻糖合酶(MTSase)与麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)以及古菌Thermoplasma acidophilum来源的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(TPP)进行克隆表达研究,以期通过对古菌来源的海藻糖合成关键酶类的研究,为酶法工业生产海藻糖提供理论依据。⑵麦芽寡糖基海藻糖合酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶是TreY/TreZ海藻糖合成途径的关键酶。在本研究中,首先从嗜热古菌S. tokodaii strain7中克隆、表达了麦芽寡糖基海藻糖合酶与麦芽寡糖基海藻糖水解酶,然后进一步对麦芽寡糖基海藻糖合酶的酶学性质进行了研究。酶学性质研究表明,该酶的最适温度为75℃,最适pH为5,并且具有很强的热稳定性和pH稳定性。该酶能够对多种金属离子和有机溶剂具有一定的耐受性。底物特异性研究发现该酶能够利用麦芽糊精和麦芽五糖作底物,而不能利用壳寡糖、麦芽糖、β-环糊精。通过以上酶学性质的研究,说明来源于嗜热古菌S. tokodaii strain7的麦芽寡糖基海藻糖合酶在工业生产海藻糖领域具有一定的应用前景。⑶古菌T.acidophilum来源的海藻糖-6-磷酸磷酸化酶(taTPP)是TPS/TPP途径中参与海藻糖合成的关键酶之一。从古菌T. acidophilum中克隆、表达纯化了海藻糖-6-磷酸磷酸化酶。酶学性质研究表明该酶最适反应温度为50℃,最适pH为9。该酶的温度稳定性 pH稳定性不强。在金属离子方面,Mg2+对酶的活性有强烈的激活作用,而Mn2+、Co2+能轻微激活酶活性。酶促反应动力学研究表明,在以对硝基苯磷酸(p-nitrophenylphosphate, pNPP)为底物时,酶对底物的Vmax=0.048μmol/min,Km=5.4mM。⑷通过对以上古菌来源的海藻糖合成关键酶类的研究,可以为酶法工业生产海藻糖垫定一定的理论基础。
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