甜菜夜蛾Spodoptera exigua(Hübner)属鳞翅目夜蛾科,是一种世界性分布、杂食性、间歇性暴发的重要农业害虫。由于化学防治是控制甜菜夜蛾的主要方法,使其对常用杀虫剂的抗性问题较为突出,传统杀虫剂如有机氯、有机磷、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯等已不能有效控制甜菜夜蛾的为害。目前生产上用于防治甜菜夜蛾的药剂主要包括甲维盐、茚虫威、溴虫腈、多杀菌素和虫酰肼等新型作用方式杀虫剂,这些新型杀虫剂广泛应用可能导致的抗性问题,将会同样严重威胁到甜菜夜蛾田间种群的有效控制。本文系统监测了我国蔬菜主产区甜菜夜蛾对甲维盐等9种杀虫剂的抗性情况,明确了甜菜夜蛾的抗药性现状及动态;通过室内筛选获得了甜菜夜蛾对甲维盐的高抗品系(WH-EB),并对其抗性特性进行了研究,明确了交互抗性谱(仅对阿维菌素具有高水平交互抗性)及抗性遗传方式(受多因子控制),并发现该抗性种群没有适合度代价。上述研究结果对于制定甜菜夜蛾科学合理的轮换用药方案具有重要指导意义。解毒酶抑制剂的增效作用及解毒酶活性的研究均表明,解毒代谢酶不是甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐产生抗性的主要原因;通过RNA干扰试验证明了甜菜夜蛾谷氨酸受体α亚基(SeGluClα)和GABA受体α1亚基(SeGABAα1)是甲维盐的两种不同作用靶标,但这两个靶标基因的氨基酸序列及mRNA表达水平在抗性和敏感品系间没有差异。通过转录组分析发现WH-EB抗性品系被家蚕微孢子虫Nosema bombycis感染,并证实了家蚕微孢子虫的转运蛋白基因NbABCG1参与了甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐抗性的形成。上述研究首次发现了甜菜夜蛾和家蚕微孢子虫之间基于甲维盐抗性的互利共生关系,揭示了昆虫对甲维盐产生抗性的一种新途径。1.甜菜夜蛾田间种群的抗药性监测2009-2013年连续五年对中国7个省18个甜菜夜蛾田间种群开展了 9种不同类型杀虫剂的抗药性监测。与室内敏感品系(WH-S)相比,各地田间种群对这9种药剂表现出了不同水平的抗药性,其中甲维盐抗性4-403倍、茚虫威抗性2-41倍、氯虫苯甲酰胺抗性2-44倍、多杀菌素抗性5-38倍、虫酰肼抗性2-87倍、啶虫隆抗性3-31倍、毒死蜱抗性8-3080倍、高效氯氰菊酯抗性79-1240倍,但对溴虫腈无明显抗性(0.1-7倍)。连续五年的监测数据还显示,各地不同种群的抗药性水平差异与用药历史有很大的关系,相距300公里的LH(江苏六合)和FX(上海奉贤)种群对各种药剂的抗性水平完全不同。LH种群对毒死蜱的抗性(877-3080倍)明显高于FX种群(8-110倍);FX种群对虫酰肼为中等水平抗性(13-87),但是LH种群对虫酰肼无抗性(2-6倍);LH种群对另外一种昆虫生长调节剂啶虫隆有中等水平抗性(21-31倍),但是FX种群对该药剂无抗性(3-5倍)。比较各地抗药性监测结果可以看出,各地甜菜夜蛾对不同杀虫剂的抗性水平差异较大,因此在甜菜夜蛾防治工作中应当加强抗药性监测,并根据不同地区的抗药性现状制定合理的用药方案以延缓抗性的发展。2.甜莱夜蛾抗甲维盐近等基因系的建立及交互抗性和抗性遗传方式利用重复回交法,将甲维盐抗性种群CM-EB与敏感品系WH-S多次回交后再自交,每代均用甲维盐进行药剂处理,获得了甜菜夜蛾抗甲维盐近等基因系WH-EB。和WH-S相比,WH-EB对甲维盐有1110倍抗性,对阿维菌素有202倍的高水平交互抗性,对啶虫隆和高效氯氰菊酯有7-10倍的低水平交互抗性,对其他6种药剂(溴虫腈、茚虫威、多杀菌素、氯虫苯甲酰胺、虫酰肼和毒死蜱)均无交互抗性。抗性和敏感品系正反交F1代对甲维盐的LC50值分别为9.94mg/L和12.4mg/L,正反交F1代的显性度D值为0.6,表明甜菜夜蛾对甲维盐的抗性为常染色体、不完全显性遗传;同时,基于三种不同统计方法的验证均表明抗性由多基因控制。3.甜菜夜蛾抗甲维盐抗性品系WH-EB的相对适合度通过构建室内种群生命表,对抗甲维盐近等基因系WH-EB和敏感品系WH-S、对照品系CM和室内筛选甲维盐抗性品系CM-EB两组对应品系的相对适合度进行了研究。生长特征比较上,WH-EB比WH-S在幼虫历期上减少0.2天,CM-EB与对照品系CM相比,在幼虫历期上减少0.3天,差异均不显著。WH-EB、CM和CM-EB的雌蛹重显著高于敏感品系WH-S,在蛹历期、化蛹率和雄蛹蛹重等方面,四个品系间无显著差异。WH-EB品系的蛹存活率显著低于其他三个品系。在繁殖特征方面,WH-S、WH-EB和CM-EB单头雌蛾平均产卵量在700-900粒之间,CM品系的单雌产卵量达到1000粒,高于其他品系。四个品系的卵孵化率在50%到60%之间,并无显著差异。WH-S、WH-EB、CM和CM-EB四个种群的净增殖率分别为 165.2、175.8、189.7、217.8,WH-EB与WH-S相比的相对适合度为1.06;CM-EB与CM相比的相对适合度为1.15,均无显著差异。说明在室内人工饲料上相对于敏感品系和对照品系,甲维盐抗性近等基因系WH-EB和抗性品系CM-EB未表现出明显的适合度代价。4.甜菜夜蛾甲维盐抗性品系WH-EB的代谢和靶标机理通过活体增效实验测定了三种代谢酶抑制剂PBO、DEM、DEF对甲维盐的增效作用,结果表明三种增效剂在敏感品系WH-S上的增效作用为1-2.1倍,在抗甲维盐近等基因系WH-EB上的增效作用为1-1.5倍。多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶和酯酶活力测定结果显示,WH-EB的三种解毒代谢酶活力相对于WH-S在0.7-1.6倍之间,没有显著提高。活体增效作用和离体代谢酶活性测定结果均表明代谢酶介导的解毒作用不是WH-EB对甲维盐产生高水平抗性的主要原因。采用RT-PCR和RACE克隆得到了甜菜夜蛾谷氨酸氯离子通道基因SeGluClα和γ-氨基丁酸氯离子通道基因SeGABAα1,分别用SeG1uClα和SeGABAα1的dsRNA饲喂甜菜夜蛾幼虫,两个基因的表达分别下降了 69%和77%,同时甲维盐对饲喂后幼虫的致死率显著下降,证明了甜菜夜蛾SeGluClα和SeGABAα1基因是甲维盐在甜菜夜蛾中的作用靶标。但这两个基因在甲维盐抗性品系WH-EB和敏感品系WH-S间不存在保守的基因突变位点,并且抗性品系与敏感品系在mRNA水平上的表达量也没有显著差异,表明这两个靶标基因在抗性品系中未发生与甲维盐抗性相关的变化。5.家蚕微孢子虫ABCG1基因与甜菜夜蛾对甲维盐抗性的关系为了研究甜菜夜蛾抗性、敏感品系在基因转录水平上的差异,对两个品系的三龄幼虫进行了转录组测序,并分析发现WH-EB中含有大量家蚕微孢子虫的序列,而WH-S品系中没有。对WH-EB幼虫镜检发现体内存在大量微孢子虫的孢子,并通过SSU和IGS序列鉴定证实为家蚕微孢子虫。WH-EB成虫连续2代取食含烟曲霉素(Fumagillin)的蜂蜜水后其幼虫体内家蚕微孢子虫的孢子数量下降了 60%,对甲维盐的抗性倍数也下降到原来的一半;感染一定孢子量的家蚕微孢子虫可以使甜菜夜蛾对甲维盐的抗性提高17倍。因此,甜菜夜蛾体内存在家蚕微孢子虫感染是WH-EB品系对甲维盐产生抗性的原因之一。ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米(Verapamil)在WH-EB品系中对甲维盐具有6倍的增效作用,在WH-S中没有增效作用。转录组测序结果中得到了 8个家蚕微孢子虫ABC转运蛋白家族基因,其中的ABCG1基因(NbABCG1)的表达量最高。同时克隆了甜菜夜蛾的SeABCG1和SeABCB1基因,qPCR分析表明抗性和敏感品系间的表达量无明显差异。RNA干扰实验证实,饲喂甜菜夜蛾幼虫NbABCG1的dsRNA,导致NbABCG1基因的表达下降而SeABCG1的表达不受影响,同时使甜菜夜蛾对甲维盐的敏感性明显上升。因此,家蚕微孢子虫NbABCG1是WH-EB对甲维盐产生抗性的因素之一。