研究背景在我国,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的发病率呈现出高速发展趋势,据2013年发表在JAMA的研究表明,我国T2DM的患病率已达到11.6%,总患病人数达1.14亿,跃居世界第一位,已成为继肿瘤、心血管病变之后的第三大严重威胁人们健康的慢性病。预计到2025年,我国罹患糖尿病人数将达3亿之多,严重影响人类的生命健康和社会的发展。糖尿病高危的遗传背景加上外在的环境因素,最终将导致胰岛p细胞功能缺陷。由于遗传背景不同,人群中存在对2型糖尿病相对易感人群,在同等条件下,他们更容易患2型糖尿病,临床上称之为“遗传易感性”。这与相关基因表达异常有关,而对于累积的相关基因表达异常是否已经发展到“临界点”,仅凭空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)或者餐后血糖(postprandial plasma glucose, PPG)等外在表型来间接判断并不可靠,因此深入探索糖尿病易感基因及表达改变情况,认识其发病机理,对糖尿病的早期诊断和个体化治疗具有重要意义。非编码RNA (non-coding RNA)近来成为生命科学中的研究热点,被称为生命体中的“暗物质”,广泛参与人体病理生理活动,其调控失衡可参与众多疾病的发生。非编码RNA是一大类不编码蛋白质,但在细胞中起着调控作用的基因分子。大量研究表明,一系列重大疾病的发生发展与非编码RNA的调控失衡相关。其中,长链非编码RNA (lncRNA)是转录本长度超过200个核苷酸单位的非编码RNA分子,广泛参与机体几乎所有的生理和病理过程,可通过与相应的靶基因形成复合体,促进或抑制靶基因的降解、翻译等过程,在表观遗传水平、转录水平及转录后水平等多种层面上调控基因的表达。近年研究提出,lncRNAs的异常表达与肿瘤、心血管疾病、感染、神经系统疾病以及糖尿病等复杂疾病的发生发展密切相关,具有促进或抑制疾病发生的作用。如某些组织特异的lncRNAs差异表达于正常组织、不典型增生组织或肿瘤组织中,可作为肿瘤的预测因子。lncRNAs也存在于人的循环血液系统中,并能够从外周血中稳定检测：如前列腺癌特异的lncRNA DD3(也称为PCA3)已被发展为高度特异性的核酸分子标志物,且特异性高于血清前列腺癌特异性抗原(PSA)。目前,lncRNAs在肿瘤等领域的研究方兴未艾,但有关lncRNAs与2型糖尿病发生机制的研究仍处于起步阶段,特别是其在2型糖尿病患者外周血中的表达情况尚未见报道。初步研究揭示lncRNAs与β细胞发育、增殖,胰岛素的产生等密切相关,提示lncRNAs可能参与调控胰岛β细胞功能缺陷及2型糖尿病的发生发展过程。另一方面,由于T2DM患者的胰岛组织标本极难获得,因此如果外周血lncRNA能够作为临床标记物应用,这对于T2DM患者具有更为显著的意义。综上,本研究拟通过lncRNA基因芯片构建2型糖尿病患者外周血差异表达的lncRNA表达谱,筛选和鉴定与T2DM发生和发展密切相关的lncRNA,并通过生物信息学分析目的基因的功能。通过横断面研究进一步分析2型糖尿病中差异表达的lncRNA与胰岛功能的相关性,以期为T2DM早期诊断及治疗提供新的策略。本课题分以下两部分：第一章2型糖尿病差异表达lncRNAs的鉴定和功能研究目的通过lncRNA基因芯片分析2型糖尿病(T2DM)患者和健康对照组的外周血中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA)和mRNA。运用生物学功能聚类、KEGG信号通路分析挑选与2型糖尿病胰岛素信号通路密切相关的lncRNAs。通过进一步构建lncRNA-mRNA调控网络及靶基因预测,分析差异表达的lncRNAs在2型糖尿病发病过程中可能参与的调控机制。方法1、收集性别、年龄相匹配的新诊断2型糖尿病患者及健康对照患者外周血样本各3例,记录受试者一般资料,分离提取总RNA。2、采用lncRNAs表达谱芯片检测2型糖尿病患者差异表达的lncRNAs及mRNA,以差异倍数(FC值)大于或等于2,且p<0.05为标准,筛选出2型糖尿病组与健康对照组比较存在差异表达的lncRNAs和mRNA。3、采用生物信息学分析挑选与胰岛素信号通路相关的lncRNAs,预测其靶基因,构建IncRNAs-mRNA共表达网咯：应用ENCODE数据,采用GO与KEGG Pathway聚类,对差异基因可能富集的生物信息学功能进行分析,挑选与胰岛素信号通路相关的lncRNAs。利用pearson相关系数预测差异表达的lncRNA及共表达的mRNA,并在lncRNA和mRNA共表达的基础上通过顺式(cis-)预测和反式(trans-)预测候选基因的靶基因。cis-预测寻找位于基因组位置的10kb以内的lncRNA-mRNA对；trans-预测借助Blat工具,比较lncRNA和mRNA(3’UTR)的序列,进而筛选序列相似的lncRNA-mRNA对。结果1、lncRNA芯片结果分析显示,2型糖尿病患者组和健康对照比较存在2270个显著差异的lncRNAs,其中1891个lncRNAs表达上调,379个lncRNAs表达下调；有2194个显著差异的mRNA,其中653个mRNA表达下调,1541个mRNA表达下调。2、对2型糖尿病患者外周血中差异表达的基因进行生物信息学分析：GO功能分析表明,差异表达lncRNA与转录调控、RNA代谢过程调控、RNA基因沉默、细胞表面受体信号转录、免疫应答、防御反应、细胞增殖、细胞凋亡等功能相关。KEGG信号通路分析表明,lncRNA相关mRNA转录本的信号通路主要富集在Jak-STAT信号通路、胰岛素信号通路、肿瘤相关信号通路以及Toll样受体信号通路等。(p<0.01)。从中挑选与胰岛素信号通路相关,且差异表达最显著的前六位基因,分别为Inc-p3134, lnc-p25201, lnc-p34005_v4, Inc-p18324, Inc-p12792, lnc-RNA143599进一步分析其表达水平与2型糖尿病糖脂代谢和胰岛功能的相关性。3、运用生物信息学分析发现,lnc-p 12792与23个mRNA存在共表达,并且这些mRNA与胰岛素信号通路密切相关。通过靶基因预测软件,发现转录因子类似物2 (TCF7L2)基因是Inc-p12792基因的调控靶标。TCF7L2是被确认的2型糖尿病易感基因,且被证实是与糖代谢障碍关联性最强的蛋白编码基因,与葡萄糖诱导的胰岛素分泌密切相关。TCF7L2可影响胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的合成来阻断胰岛素信号通路,诱导胰岛素分泌缺陷或胰岛细胞功能障碍。结论2型糖尿病患者外周血中存在差异表达的长链非编码RNA,参与转录调控、RNA代谢过程调控、RNA基因沉默等过程,主要涉及多种信号通路调控,其中lncRNA-p12792及其靶基因TCF7L2涉及胰岛素信号相关通路,可能参与调控T2DM的发生发展过程,提示incRNA-p 12792可能是潜在的2型糖尿病的分子标志物。第二章2型糖尿病相关IncRNAs与胰岛p细胞功能的相关性研究目的探讨6个糖尿病相关的lncRNAs(lnc-p3134, lnc-p25201, lnc-p34005_v4, Inc-p18324, Inc-p12792, lnc-RNA143599)在2型糖尿病患者外周血中的表达情况,及其与糖、脂代谢指标及胰岛p细胞功能的相关性,为T2DM早期诊断及胰岛功能评估寻找新的生物标志物。方法1、收集新诊断2型糖尿病及健康对照组患者外周血样本各30例,记录受试者一般资料,分离提取总RNA。2、采用实时荧光PCR验证候选lncRNAs的相对表达水平：结合芯片及生物信息学分析结果,选取与胰岛素信号通路相关的lncRNAs,并从中挑选差异表达最显著的前六位基因,采用real-time PCR技术,验证2型糖尿病组(n=30)及健康对照组(n=30)外周血差异基因的表达水平,采用两独立样本t检验比较两组差异基因的表达水平。3、检测两组患者的体重指数(body mass index,BMI),腰臀比,行口服葡萄糖耐量试验(OGTT),采用葡萄糖氧化酶法检测空腹及75g葡萄糖负荷后2小时血糖,采用化学微粒子免疫法检测空腹及餐后2小时胰岛素,采用放射免疫测定法检测空腹及餐后2小时C肽,采用稳态模型胰岛素分泌指数(HOMA-p)评估胰岛β细胞胰岛素分泌功能,稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评价胰岛素抵抗水平,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测白介素6 (interleukin 6,IL-6)、超敏C反应蛋白(hyper-sensitive C-reactive protein, hsCRP)的水平,全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),采用Spearman相关分析及多元逐步回归分析差异表达的lncRNAs与相关代谢指标及胰岛功能的相关性,采用ROC曲线评估目的基因在2型糖尿病中的诊断价值。结果1、与正常对照组相比,2型糖尿病患者外周血中Inc-p3134, lnc-p25201, lnc-p 18324, lnc-p 12792,以及lnc-RNA143599表达显著高于正常对照组,lnc-p34005_v4表达显著低于正常对照组(P均<0.01),PCR验证结果与基因芯片结果一致。2>. Spearman相关分析表明,Inc-p3134与年龄、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C呈正相关(p均<0.05),与HOMA-p呈负相关(r=-0.412,p<0.05),与BMI、空腹胰岛素、TC. HDL-C、IL-6、hsCRP无相关性(p均>0.05)；lnc-p 12792与BMI、腰臀比、FBG、TC呈正相关(p均<0.05),与HOMA-β呈负相关(r=-0.484,p<0.05),与年龄、空腹胰岛素、空腹C肽、HOMA-IR、TG、LDL-C、HDL-C、IL-6. hsCRP无相关性(p均>0.05)；lnc-RNA143599与年龄、BMI、腰臀比、FBG、空腹C肽、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C呈正相关(p均<0.05),与HOMA-β (r=-0.398)、 HDL-C呈负相关(p均<0.05),与空腹胰岛素、IL-6、hsCRP无相关性(p均>0.05)；lnc-p25201与腰臀比、FBG、HOMA-IR、TG呈正相关,与其余指标无相关性(p均>0.05)；Inc-p18324 与 FBG、HOMA-IR、hsCRP、TG呈正相关(p均<0.05),与其余指标无相关性(p均>0.05)；lnc-p34005_v4与年龄及FBG呈负相关(p均<0.05),与其余指标无相关性(p均>0.05)。3、多因素Logistic回归分析发现,外周血Inc-p12792表达水平高的个体,糖尿病发病风险显著上升,矫正OR值为1.96。多元逐步回归分析结果显示,FBG(P=0.394, p<0.01)、BMI(β=0.379, p<0.01)以及HOMA-P(p=-0.391, p<0.01)是影响外周血lnc-p12792的独立因素。通过对血糖水平进行分层,进一步发现随着空腹血糖水平逐渐升高,外周血lnc-p12792的表达水平也逐渐升高,各组间比较差异均有统计学意义(p均<0.05)。采用ROC曲线评估lnc-p12792基因在2型糖尿病中的诊断价值,敏感性为66.7%,特异性为83.3%。结论2型糖尿病患者外周血中Inc-p3134, lnc-p25201, Inc-p18324, Inc-p12792,以及lnc-RNA143599表达显著升高,lnc-p34005_v4表达显著降低。其中Inc-p12792是2型糖尿病发病的独立危险因素,与BMI、空腹血糖和HOMA-β水平显著相关,推测其上调可能与糖、脂毒性诱导的胰岛p细胞功能缺陷有关,对2型糖尿病的发生有预测意义。