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酒精性脂肪肝（Alcoholic liver disease,ALD）是一种潜在的病理状态,如果不加以干预,可进一步发展为肝炎、纤维化和肝硬化。中脑星形细胞源性神经营养因子（Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF）是一种新型的神经营养因子。最近的研究表明,MANF在肝脏的稳态和肝脏疾病的发病机制中发挥重要作用,然而MANF在肝脏脂肪代谢中的作用及相关机制仍有待进一步阐明。我们前期研究发现MANF在ALD小鼠的肝组织中表达上调,肝细胞选择性MANF敲除会加重酒精性脂肪肝,降低精氨基琥珀酸合酶（Argininosuccinate synthase,ASS1）活性,且免疫共沉淀耦联质谱分析数据显示MANF与ASS1可能存在互作,而ASS1又是介导尿素循环激活AMP依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK）脂代谢通路的关键因子。因此我们假设:MANF通过与ASS1互作激活ASS1进而激活AMPK及其下游脂代谢通路来拮抗酒精性脂肪肝。目的:研究MANF对酒精诱导的肝脂肪变性的改善,以及通过增强ASS1活性参与肝脂肪代谢的机制。方法:利用肝细胞选择性MANF敲除小鼠（Hepatocyte MANF specific knockout mice,HKO）和野生型小鼠（Wild type,WT）通过慢性酒精喂养加急性酒精灌胃方式（Gao-Binge模型）构建ALD模型小鼠,在造模前及造模过程中,设重组人MANF给药组（2 mg/kg体质量/天,腹腔注射）及载体对照组。利用生化分析仪检测谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）,天冬氨酸转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）等生化指标,苏木素-伊红染色法（Hematoxylin-eosin,HE）染色和油红染色观察肝脂滴沉积;高效液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS/MS）测量模型鼠肝组织中尿素循环中间体浓度。分离HKO鼠原代肝细胞观察MANF敲除对ASS1酶活性的影响;蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和实时荧光定量PCR检测MANF,ASS1的表达以及AMPK信号通路中调控脂肪酸合成和β-氧化的关键因子的水平。采用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CO-IP）,免疫荧光双标验证了MANF与ASS1的互作。采用si RNA敲低ASS1表达等方法证明MANF对AMPK的影响及参与脂肪代谢的调控是ASS1介导的。结果:1.MANF在Gao-Binge模型小鼠的肝组织中表达上调我们在野生型小鼠中建立了Gao-Binge模型,发现在酒精造模后的小鼠肝组织中MANF的m RNA水平和蛋白水平显著升高。2.HKO小鼠在酒精喂养后表现出更严重的肝脂肪变性和急性肝损伤指标随后我们又对HKO小鼠进行酒精造模,血清和肝组织生化指标检测,HE染色以及油红染色发现小鼠在MANF敲除和酒精造模后肝损伤进一步加重,且出现了大量的脂滴积累。3.HKO小鼠与WT小鼠肝脏尿素循环代谢产物表现出不同的模式我们用LC/MS-MS检测各组肝组织尿素循环代谢物的水平,发现与WT小鼠相比,HKO小鼠肝组织中的瓜氨酸、鸟氨酸和精氨酸增加。在WT小鼠中,长期过量酒精摄入诱导血清尿素水平升高。此外,纳氏染色结果显示,酒精摄入导致HKO小鼠肝脏切片中氨的积累量高于WT小鼠肝脏切片。4.肝细胞MANF缺失加重酒精对AMPK通路的抑制在酒精摄入后,磷酸化AMPK的比例下降,肝细胞MANF缺失后,肝组织中AMPK的磷酸化比例降低。并且酒精导致的AMPK磷酸化水平在HKO小鼠中下降的比WT小鼠更明显。与脂质代谢相关的AMPK下游基因如screbp1和fasn的转录水平在肝细胞MANF缺失后显著升高,而ACC1（acaca）m RNA水平没有改变。5.MANF与ASS1存在于同一免疫复合物中我们使用CO-IP验证了免疫共沉淀耦联质谱分析的数据,结果显示MANF和ASS1位于同一个免疫沉淀复合物中。在正常细胞培养条件下以及酒精刺激后观察MANF和ASS1的细胞内定位。共聚焦结果表明,酒精促进了MANF和ASS1在细胞质中的共定位。6.MANF正向调节ASS1活性MANF敲除后,HKO小鼠肝组织中ASS1的m RNA和蛋白水平均略有升高。而在MANF缺失的肝细胞中,ASS1活性降低。在过表达MANF-Flag的HEK293T细胞中,尽管ASS1的蛋白保持在相似的表达水平,但ASS1的活性增强。7.补充MANF改善酒精诱导的HKO小鼠肝脏脂肪变性为了进一步明确MANF对酒精肝的保护作用,我们给予了小鼠重组人MANF。结果显示,给MANF后小鼠肝组织上清的谷丙转氨酶,甘油三酯,总胆固醇水平降低了,并且AMPK通路的抑制也得以改善。8.MANF通过抑制酒精诱导的AMPK失活改善肝脏脂肪变性我们在体外评估MANF对酒精所导致的的AMPK去磷酸化和脂滴积累的影响。发现补充MANF可以显著降低酒精所诱导的AMPK去磷酸化水平和Hep G2细胞中脂滴的积累。9.MANF激活AMPK的机制部分是ASS1依赖的我们使用了ASS1的si RNA敲低了Hep G2细胞的ASS1,发现MANF的抗脂肪变性作用部分减弱。此外,在ASS1被敲低后,Hep G2细胞中磷酸化的AMPK水平降低,提示MANF对AMPK激活的影响部分是ASS1依赖性的。结论:在本研究中,我们发现在WT小鼠的Gao-Binge模型中,肝脏中的MANF表达上调。肝细胞选择性MANF敲除的小鼠在长期加过量酒精喂养后表现出更严重的脂肪变性和肝损伤。MANF通过增加ASS1的活性促进尿素循环中AMP的产生,进而激活AMPK及其下游脂质代谢途径,抑制酒精所诱导的肝脂肪变性从而发挥对肝细胞的保护作用。