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非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种高致死率的出血性猪传染性疾病。自2018年8月在中国首次爆发以来,给我国养猪业带来了巨大的经济损失。截止今日,尚无商业化疫苗或有效的治疗方法用于预防或治疗ASF疾病。天然弱毒株以及敲除ASFV毒力基因的重组减毒活疫苗(Live Attenuated Vaccine,LAV)具有较好的保护力,但是存在毒力增强以及引发持续感染的风险;ASF亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗安全性高和有一定的疫苗保护效力,因此在研发ASF疫苗方面具有更大的研究潜力和优势。因而我们选择能在机体中持续稳定表达ASF抗原蛋白的重组腺相关病毒(recombinant Adeno-associated virus,r AAV)作为ASF的病毒载体疫苗候选株。主要研究内容如下:1.构建ASFV单抗原r AAV载体疫苗候选株通过r AAV的三质粒分别共转染HEK293细胞,进行r AAV病毒包装,获得表达抗原基因的重组腺相关病毒r AAV-B646L-HA、r AAV-EP153R-HA、r AAV-B119L-HA、r AAV-O61R-HA、r AAV-CP204L-HA和r AAV-E183L-HA。2.ASFV单抗原r AAV载体疫苗免疫候选株接种及免疫原性评估免疫组小鼠分别在第0 d以及21 d以相同剂量对小鼠进行肌肉注射r AAV混合液(每种病毒的接种剂量为2x10~6CFU,总接种剂量为1.2x10~7CFU);对照组小鼠接种1.2x10~7CFU的r AAV-GFP病毒。小鼠免疫后14、21、35、50 d分别进行尾静脉采血,分离血清并进行ELISA测定抗原特异性抗体,免疫组小鼠均检测到B646L、CP204L和E183L编码抗原的特异性抗体的产生;通过q RT-PCR以及流式分析检测细胞免疫的实验结果表明:与对照组小鼠相比,免疫组小鼠(1)脾脏淋巴细胞极显著增多(P<0.01),(2)细胞因子IFN-α、IL-6和IFN-γ的表达水平显著上升(P<0.05),(3)脾脏淋巴细胞中CD4~+T细胞极显著增加(P<0.01),CD8~+T细胞虽有上调趋势,但是差异不显著(p>0.05)。3.构建ASFV多抗原r AAV载体疫苗候选株包装r AAV获得表达抗原基因的重组腺相关病毒r AAV-ASFV-1(B646L、EP153R、B119L、O61R)、r AAV-ASFV-2(EP402R、E183L)和r AAV-ASFV-3(A141R、A151R、B438L、B602L、K205R)。4.ASFV多抗原r AAV载体疫苗免疫候选株接种及免疫原性评估免疫组小鼠分别在第0 d以及21 d以相同剂量对小鼠进行肌肉注射r AAV混合液(每种病毒的接种剂量为2x10~6CFU,总接种剂量为6x10~6CFU);对照组小鼠接种6x10~6CFU的r AAV-GFP病毒。小鼠免疫后14、21、35、56 d分别进行尾静脉采血,分离血清并进行ELISA测定抗原特异性抗体,免疫组小鼠均检测到B646L、EP153R、B119L、O61R、E183L、A151R和B602L编码抗原的特异性抗体的产生;检测细胞免疫的实验结果表明与对照组小鼠相比,免疫组小鼠(1)脾脏淋巴细胞显著增多(P<0.05),(2)细胞因子IFN-α、IL-6和IFN-γ的表达水平均无差异显著性(P>0.05),(3)脾脏淋巴细胞中CD4~+T细胞极显著增加(P<0.01),CD8~+T细胞有增多趋势,但无差异显著性(P>0.05)。本实验成功构建能表达ASFV B646L、EP153R、B119L、O61R、EP402R、E183L等13个基因的单抗原与多抗原r AAV载体疫苗候选株。接种两种候选株的小鼠血清中均能检测到抗原特异性抗体的产生,脾脏淋巴细胞中均表现出CD4~+T细胞增多。接种单抗原r AAV候选株的小鼠脾脏细胞的IFN-α、IL-6和IFN-γ细胞因子表达增多。