背景和目的：WHO资料显示，在发达国家，高胆固醇对人类健康的威胁已上升到第四位，其中因胆固醇代谢紊乱而致胆囊结石的发病率高达7％以上，因胆囊结石切除胆囊者约占腹部外科手术的25％左右。在我国由于饮食结构的变化，因胆固醇代谢紊乱而致胆囊结石的发病率逐年提高，目前已经接近于发达国家水平。但是对于高胆固醇条件下胆囊成石环境是如何形成的并不清楚。根据胆管内胆汁的流体力学分析，肝脏分泌胆汁是肝外胆管系统内产生静水压并保持正向压力梯度的主要脏器，但在不同的生理状态下提供排胆动力的主要是胆囊及Oddi括约肌(sphincterofOddi，SO)。胆管SO是胆汁排出的唯一通道，它的功能状态是决定胆囊胆汁储存或者排空的关键因素之一。在某些致病因素作用下，损害了胆管SO的舒、缩功能(即SO功能紊乱)，必然提高了排胆阻力，其直接后果就是导致胆囊淤胆，即是在具备成石物质的基础上，为成石物质结晶的析出提供了合适的环境。有关临床资料和研究证实，胆固醇代谢紊乱可能是诱发胆管括约肌紊乱的因素之一。我们的研究结果证实，胆固醇喂养兔胆囊成石前胆囊已处于淤胆状态。胆固醇代谢紊乱不仅提供了胆囊成石的物质基础，而且很有可能是在成石物质结晶析出前高胆固醇首先损害了胆管SO舒、缩功能，即发生了由高胆固醇诱发的胆管SO功能紊乱导致胆囊淤胆，继而为胆囊内过饱和的胆固醇结晶的析出提供了适宜的环境。 研究证实在平滑肌细胞舒缩功能调节与细胞内[Ca2+]i浓度的变化有密切的关系。SO功能紊乱的发生机制尚不清楚，但是胆管SO功能紊乱是因括约肌舒缩功能障碍导致的一种疾病已经成为共识。我们的研究发现，高胆固醇所致的SO功能紊乱动物模型SO细胞[Ca2+]i存在过载现象[1]，电镜观察证实SO内细肌丝三维结构排列紊乱，处于挛缩状态。上述结果显示细胞[Ca2+]i过载可能是SO功能紊乱发生的分子机制之一。 已有研究结果证实，调节平滑肌细胞舒缩功能的关键离子—钙离子的代谢主要通过胞膜L-型电压依赖型钙通道完成，我们实验结果显示实验组胆管SO细胞[Ca2+]i过载并非系高胆固醇损害了L-型电压依赖性钙通道的活性所致[2]。已经证实，具有舒、缩运动功能的肌细胞膜电位调节的离子通道是钙离子敏感性钾离子通道(Kca通道)。当细胞[Ca2+]i上升到一定的阈值，细胞内即启动了抑制Ca2+进入和肌浆网钙库释放Ca2+的调节路径，其关键作用点就是激活细胞质膜Kca通道。显然，高胆固醇引发的胆管SO功能紊乱是否因高胆固醇改变了细胞膜Kca通道活性而导致细胞[Ca2+]i过载就成为研究热点。 有关高胆固醇或脂类物质是否会影响平滑肌细胞质膜Kca通道的活性已有报道。Amberg[3]的研究结果提示，遗传性高血压患者大电导的钙离子敏感性钾离子通道(Kca)beta亚基低表达降低了该通道对Ca2+生理性变化的敏感性而使Kca通道活性降低，这说明Kca通道的分子结构的变化是血管平滑肌功能紊乱的基础。最近对高胆固醇影响Kca通道基因表达和功能的研究显示：高胆固醇血症大鼠主动脉血管平滑肌细胞膜上Kir6.2mRNA表达明显升高，而Kir3.1mRNA表达却显著降低，充分证明了高胆固醇可以调节细胞膜钾通道mRNA表达水平[4]。尽管对高胆固醇具体从何种途径影响血管平滑肌细胞膜钾通道基因转录水平，以及是否影响Oddi氏括约肌钾通道mRNA表达的表达尚不清楚，但是XiQ，等的研究[5]却明确指出，高胆固醇血症就是通过影响Kca通道的功能，导致血管NO依赖性和非NO依赖性扩张功能减弱。上述研究提示：在某些外界致病因子(包括高胆固醇)作用下有可能导致发生基因功能损害，并因此而诱发疾病。但是外源性致病因子是否可导致调控胆管SO运动功能的基因表达异常，进而成为胆囊成石环境形成的启动因素则未见报告。 回顾文献及我们的研究结果可归纳如下几点：①胆囊成石物质代谢紊乱首先导致胆管SO功能紊乱，并因此使胆囊处于淤胆状态，为成石物质结晶析出提供了适宜的内在环境；②高胆固醇诱发胆管SO功能紊乱的分子机制是细胞内[Ca2+]i过载所致；③胆管SO细胞内[Ca2+]i过载与细胞质膜BKca通道的beta亚基活性降低密切相关；④后天致病因素(如高胆固醇、脂肪酸等)可能导致血管平滑肌BKca通道beta亚基基因功能的降低或封闭，改变了BKca通道的活性，进而改变了平滑肌的张力。 我们前期的研究成果显示SO平滑肌细胞BKca通道alpha和beta亚基mRNA表达在胆固醇组和对照组间比较没有统计学差异，但是两者的比值在两组间有明显的统计学差异。为了揭示高胆固醇血症条件下Kca通道beta亚基蛋白表达水平是否发生了变化，本课题应用多抗制备及免疫组织化学的方法探讨高胆固醇血症下Kca通道beta亚基蛋白表达水平的改变。由于Genebank中没有SO细胞BKCa通道的基因序列，我们用RT-PCR方法测定了BKCa通道alpha亚基的cDNA序列。为了进一步证实，SO平滑肌细胞BKca通道alpha和beta亚基mRNA的比值变化会影响BKCa通道的功能，我们构建了pcDNA3.1-alpha,pcDNA3.1-beta两个质粒，准备下一步转染到HEK293细胞进而测定结构变化对通道功能的影响。 实验方法和主要结果： 一、高胆固醇兔SO细胞Kca通道beta1亚基蛋白表达水平的研究 1.鼠抗兔SO细胞Kca通道beta1亚基多克隆血清的制备扩增编码兔Kca通道beta1亚基胞内段基因，在E.coliJM109菌中表达His6-beta1亚基融合蛋白，利用Invitrogen的Ni-NTA纯化试剂盒纯化融合蛋白并免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗血清，成功地获得小鼠抗兔Kca通道beta1亚基的高滴度抗血清，抗血清最高滴度达1∶64000。 2.兔SO细胞Kca通道betal亚基免疫组织化学染色免疫组织化学染色显示BK通道beta1亚基染色于平滑肌细胞膜上，高胆固醇组BK通道beta1亚基表达较对照组降低。半定量分析显示对照组灰度值为156.4±8.5，高胆固醇组灰度值为207.1±10.2，t检验显示两组间存在统计学差异(p＜0.05)。 二、兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列测定及生物信息学分析采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列，并克隆到pMD18-T载体，获得质粒pMD18-T-alpha。序列测定证实其中CDS区包括3342bp，编码1114个氨基酸。利用生物信息技术对该序列进行了分析，用NTI6.0分析了该序列的同源性与基因库中存在的人、鼠和兔骨骼肌的BKca通道alpha亚基cDNA序列，结果显示同源性为99％，98％，99％。用PSIPREDHFORMAT(PSIPREDV2.3byDavidJones)软件对蛋白的二级结构进行了预测，结果显示该段氨基酸序列有10个跨膜区。用Swiss-modle对该蛋白的三级结构进行了预测，结果显示与蛋白库中的BKca通道alpha亚基蛋白结构基本相似。 三、构建真核表达载体pCDNA3.1-alpha和pCDNA3.1-beta利用RT-PCR技术得到兔SO细胞Kca通道beta亚基编码区cDNA序列，共576bp，克隆到pMD18-T载体，获得质粒pMD18-T-beta。质粒pMD18-T-alpha和载体pCDNA3.1+分别以HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切，将pMD18-T-betaHindⅢ和BamHⅠ和载体pCDNA3.1+以HindⅢ和XhoI分别进行双酶切，10g/L琼脂糖凝胶电泳回收目的片段及载体片段，目的片断和载体片断用T4DNA连接酶4℃连接过夜，将重组表达载体转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单克隆菌落扩大培养，小量提取质粒进行酶切鉴定并测序。测序结果显示成功构建真核表达载体pCDNA3.1-alpha和pCDNA3.1-beta，为下一步转染HEK293细胞做好了物质准备。 小结： 1.我们制备了鼠抗兔SO细胞Kca通道beta1亚基多克隆血清，并进行了免疫组织化学染色，结果显示高胆固醇组兔SO细胞Kca通道beta1亚基蛋白表达下降。 2.我们采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道alpha亚基cDNA序列，其中CDS区包括3342bp，编码1114个氨基酸。并利用生物信息技术对该序列的同源性、二级结构及三级结构进行了分析。 3.我们采用RT-PCR的方法成功得到兔SO细胞Kca通道beta亚基开放读框区cDNA序列，成功构建了真核表达载体pCDNA3.1-alpha和pCDNA3.1-beta，为下一步转染HEK293细胞做好了物质准备。