类黄酮与胰蛋白酶相互作用特性的研究

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类黄酮是一类植物次级代谢产物,广泛存在于蔬菜、水果、花卉中,因为其生物学功能,比如抗氧化性、抗菌、抗癌、护肝等而在医药、食品工业领域得到广泛的开发和利用。由于类黄酮分子中多含有活性酚羟基,经口摄入后,可能与消化道内的酶蛋白发生结合作用,进而影响其生物活性的有效发挥和酶的催化活性。所以,本文选取了几种结构上具有代表性的类黄酮(槲皮素、木犀草素、芦丁、芹菜素、山奈酚、香叶木素、二氢杨梅素、柚皮素),研究了类黄酮与胰蛋白酶相互作用后各自特性的变化,探讨类黄酮-胰蛋白酶相互作用的规律。在研究类黄酮对胰蛋白酶催化活性的影响的过程中,首先确定了反应pH、反应时间和添加量对类黄酮-胰蛋白酶相互作用的影响,槲皮素对胰蛋白酶催化活性有明显的抑制作用,在37℃反应10min后,0.8μmol的槲皮素对胰蛋白酶溶液(2.67×107U)的催化活性的抑制率达到32.5%;反应时间对两者的作用影响并不明显,槲皮素对胰蛋白酶催化活性的抑制作用属于可逆的竞争性抑制;二氢杨梅素对胰蛋白酶催化活性有明显的抑制作用,在37℃下反应10min之后,0.8μmol的二氢杨梅素对胰蛋白酶溶液(2.67×107U)的催化活性的抑制率达到34.8%;实验中同样条件下,二氢杨梅素、槲皮素、芹菜素、山奈酚、木犀草素、芦丁对胰蛋白酶的催化活性均有一定程度的抑制作用。当类黄酮浓度为0.8μmol时,槲皮素对胰蛋白酶活性的抑制率达到最大,为46%左右。类黄酮对胰蛋白酶活性的抑制率大小为槲皮素>木犀草素>山奈酚>芦丁>芹菜素。在研究类黄酮对胰蛋白酶荧光光谱和稳定性的影响过程中,发现,所试验的几种类黄酮对胰蛋白酶的荧光特性均具有不同程度的猝灭现象,并且随着类黄酮的浓度逐渐增大,胰蛋白酶在最大发射波长处的荧光强度发生规律性的降低;几种类黄酮对胰蛋白酶的荧光猝灭类型均为静态猝灭,其猝灭速率常数均大于2.0×1010L·mol-1·S-1。几种类黄酮对胰蛋白酶荧光猝灭效应强弱顺序为槲皮素>木犀草素>山奈酚>芦丁>芹菜素>香叶木素,而二氢杨梅素和柚皮素与胰蛋白酶的相互作用程度要更弱;芹菜素、槲皮素和山奈酚与胰蛋白酶相互作用的复合物其热稳定性以及pH稳定性均有一定程度的提高。在研究胰蛋白酶对类黄酮抗氧化性的影响过程中,发现,胰蛋白酶对类黄酮清除ABTS+、DPPH自由基、羟自由基的能力均具有明显的削弱作用。当反应体系中槲皮素浓度为1μmol/L,胰蛋白酶含量为1.03mg (2.67×107U),与胰蛋白酶37℃下作用10min后,槲皮素对ABTS+、DPPH自由基、羟自由基的清除率分别下降39.1%、41.0%、42.1%。胰蛋白酶对五种类黄酮抗氧化效果的削弱作用大小顺序依次为:槲皮素>木犀草素>芦丁>山奈酚>芹菜素。
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