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脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统原发性恶性肿瘤,约占颅内肿瘤40～60%。尽管手术切除、放疗、化疗等常规治疗方法有很大进展,但是胶质瘤病人预后仍然很差,恶性胶质瘤平均生存时间约12～14个月。随着对中枢神经系统和胶质瘤免疫学特性的深入研究和认识,免疫治疗被视为有前景的肿瘤治疗新模式,而治疗性的肿瘤疫苗一直是脑胶质瘤免疫治疗研究的热点。胶质瘤细胞具有免疫原性弱、MHC分子表达低、缺乏共刺激分子和粘附分子表达,并能够产生免疫抑制细胞因子等特性,不仅抑制肿瘤局部免疫细胞抗肿瘤功能,形成有利于肿瘤生长的微环境,甚至影响宿主整个免疫系统,使宿主免疫功能低下等特点,这些均是造成胶质瘤免疫逃避的原因。如何更有效地提高胶质瘤的免疫原性、增强体内和脑内抗肿瘤的特异性免疫活性、以及肿瘤疫苗的安全性,是目前脑胶质瘤疫苗研究中待解决的问题。利用细胞因子基因修饰肿瘤细胞的疫苗,可以提高肿瘤细胞的免疫原性、增强机体抗肿瘤的免疫反应。细胞因子在瘤苗局部持续表达,可刺激机体产生对抗肿瘤的特异性免疫反应。脑胶质瘤治疗中已经采用的细胞因子有GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-12、INFγ、TNFα等。其中IL-12主要由树突状细胞（dendritic cell,DC）、单核/巨噬细胞等抗原提呈细胞（antigen presentingcells,APCs）产生,主要功能有①促进THO细胞向TH1细胞分化,促进机体的细胞免疫;②促进T细胞成熟、增殖、分泌IFNγ;③促进NK细胞增殖及其杀伤活性;④促进多种黏附分子和MHC分子的表达;⑤抑制瘤体内新生血管形成,从而抑制肿瘤生长;⑥促进NO的生成,致肿瘤细胞凋亡等。IL-12被誉为最有效的抗肿瘤细胞因子之一,是连接体内天然免疫和特异性免疫的桥梁。肿瘤疫苗的失活是导致其效价降低的主要原因之一。由于缺乏可靠的控制活瘤苗细胞在体内增殖的方法,基于安全的考虑,目前所用瘤苗几乎均采用经放射线照射或抗有丝分裂药物处理灭活。研究表明,细胞因子基因修饰的瘤苗,其细胞因子的表达与细胞活性呈线性相关,经放射线处理后的瘤苗与活瘤苗比较,细胞因子分泌量显著减少。人类Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex viral thymidine kinase,HSV-TK）基因是当前研究和临床应用最多的一种自杀基因,TK基因转导的胶质瘤细胞对抗病毒药物羟甲基无环鸟苷—更昔洛韦（ganciclovir,GCV）可产生高度敏感性而被杀伤。这种HSV-TK/GCV系统,1993年在我国进行的中国单疱病毒TK基因治疗脑胶质瘤的试验研究中得到进一步证实（国家自然科学基金39370688）。我们于2000年就提出利用TK基因作为可控制因素的“脑胶质瘤活疫苗的实验研究”,已经获得广东省自然科学基金（001122）和全军医学科研“十五”计划项目基金（01MA038）的资助。我们设计,将大鼠IL-12基因和TK基因共同修饰胶质瘤9L细胞,并与树突状细胞（DC）融合,制备DC/9L/rIL-12-TK杂交瘤苗。利用该活瘤苗接种宿主,疫苗接种后一段时间,体内再给予GCV灭活瘤苗,形成既可控制瘤苗体内增殖,又可调控rIL-12分泌的活瘤苗。该疫苗可最大限度地发挥IL-12的抗肿瘤免疫效应,再者,DC可将胶质瘤细胞共同的相关抗原有效递呈,可以多克隆刺激宿主产生特异性抗胶质瘤免疫反应。本论文的研究内容为该课题中建立基因修饰肿瘤细胞疫苗部分,将为后续的研究作准备。本研究通过构建大鼠rIL-12基因真核表达质粒,先建立rIL-12基因修饰的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞株。再通过构建TK基因慢病毒载体表达质粒和建立TK基因表达的慢病毒包装系统,利用携带TK基因的慢病毒感染9L/rIL-12细胞,分步骤制备rIL-12基因和TK基因共同修饰、并稳定表达的大鼠9L/rIL-12-TK胶质瘤细胞疫苗,同时验证了HSV-TK/GCV系统在体外控制9L/rIL-12-TK瘤苗细胞增殖的作用。IL-12是由2个不相关的亚基因p40和p35编码的40kD重链和35kD轻链,经二硫键相连而成的异二聚体细胞因子,在转染哺乳动物细胞时,p40和p35必须同时等量表达才能产生有效的生物学活性的IL-12。在论文第一章中,我们通过提取Wistar大鼠腹腔巨噬细胞,经脂多糖（LPS）刺激体外培养后再提取细胞总RNA,用RT-PCR方法获取rIL-12的p40、p35两个亚基的cDNA。运用分子克隆技术,依次将p40、p35的cDNA插入pcDNA3.1（-）/myc-His A质粒中,以IRES连接双亚基,构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12。构建的重组质粒经过酶切、PCR及DNA测序等鉴定正确,为建立rIL-12基因修饰的大鼠胶质瘤细胞疫苗作基因准备。论文第二章中,我们采用两种质粒转染方法,脂质体介导的质粒转染方法和电转染方法,将构建的pcDNA3.1/rIL-12质粒转染野生型大鼠胶质瘤9L细胞,经G418筛选、有限稀释法和画圈法挑取,获得9L/rIL-12单克隆细胞株,再经ELISA方法筛选出rIL-12高表达的9L/rIL-12 clone-7细胞株。该细胞株多次传代扩增,ELISA和RT-PCR方法检定结果显示rIL-12表达稳定,可以作为建立双基因修饰瘤苗的种源细胞。第三章内容,运用分子克隆技术,限制性内切酶消化方法分别获取目的基因TK片段及慢病毒pLenti6/V5载体片段,将目的基因插入载体相应酶切位点,从而构建TK基因慢病毒载体的表达质粒pLenti6/5V-TK。构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。再利用ViraPowerTM慢病毒表达系统(ViraPowerTMLentiviral Expression Systems),建立TK基因慢病毒表达的包装体系。将构建的表达质粒与包装质粒混合物ViraPowerTMPackaging Mix（pLP1、pLP2、pLP/VSVG）4质粒共转染293T细胞,48小时后收集细胞培养上清,获得携带TK基因的慢病毒颗粒。该病毒感染大鼠胶质瘤细胞9L,经抗稻瘟菌素（BSD）压力筛选,检测病毒滴度为2.7×105 TU/ml。TK基因表达的慢病毒包装系统的成功建立,也为用于其它哺乳动物细胞的研究提供了平台。论文第四章,我们用携带TK基因的慢病毒直接感染9L/rIL-12 clone-7细胞株,经BSD筛选挑取9L/rIL-12-TK单克隆细胞株,GCV杀伤测试筛选敏感细胞株,再经ELISA检测各敏感细胞株培养上清中rIL-12 p70的分泌量,获得rIL-12和TK基因均高表达的9L/rIL-12-TK done-29。该细胞株扩增传代,ELISA方法、RT-PCR方法及GCV杀伤测试,检定各代细胞中rIL-12和TK基因均稳定表达。其中,四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色（MTT）方法检测GCV对9L/rIL-12-TKclone-29体外培养增殖抑制的效果明显,10μg/ml低浓度的GCV培养96h,肿瘤细胞生长增殖完全受到抑制,显示以9L/rIL-12-TK clone-29细胞株作为瘤苗,体外应用HSV-TK/GCV系统控制瘤苗细胞增殖效果极佳,可以用于后续的动物体内实验及与DC融合杂交瘤苗的研究。综上所述,我们分别构建大鼠IL-12基因和TK基因表达载体,并利用慢病毒作为基因高效转移的新型工具,成功建立了双基因修饰、表达稳定的大鼠胶质瘤苗9L/rIL-12-TK。该瘤苗的体外实验结果显示HSV-TK/GCV系统控制瘤苗细胞增殖即“死活”的作用可靠。尽管目前尚缺少瘤苗动物体内应用所产生的生物学效应报告,但现有的实验结果,可以验证我们应用HSV-TK/GCV系统作为活瘤苗“死活开关”的设计,为课题后续的研究打下可靠的基础。