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二甲双胍是目前治疗2型糖尿病的一线药物。其降糖的可能机制为通过抑制肝葡萄糖输出，改善外周组织对胰岛素的敏感性、增加对葡萄糖的摄取和利用而降低血糖。研究发现二甲双胍一方面能够改善氧化应激，另一方面能够增强自噬作用。但是其具体机制尚不明确。本研究拟通过观察二甲双胍在体外细胞水平对高脂诱导的L6成肌细胞自噬及氧化应激的影响，探讨其改善氧化应激、增强自噬的机制，为临床用药提供理论依据。 目的：研究SIRT3在二甲双胍改善髙脂培养肌细胞自噬及氧化应激中的作用及其机制。 方法：采用髙脂（含0.4mmol/L棕榈酸培养基）干预法建立骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型。复苏L6成肌细胞，培养并诱导分化为L6肌细胞，随机分为正常对照（Con）组和棕榈酸（PA）组，24小时后分别测定培养基中葡萄糖浓度，判断造模是否成功。造模成功后，实验分组如下，正常培养基对照组（Con）、高脂对照组（PA）、二甲双胍培养基组（PA+Met）、棕榈酸 siRNA阴性对照组（PA+siRNA）、棕榈酸 SIRT3敲低组（PA+siSIRT3）、二甲双胍siRNA阴性对照组（PA+Met+siRNA）、二甲双胍SIRT3敲低组（PA+Met+siSIRT3）。通过RT-PCR及Western Blot方法检测SIRT3 mRNA及蛋白表达水平，确定转染是否成功。采用RT-PCR检测细胞内自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ（LC3Ⅱ）、p62、Beclin1的mRNA表达水平；Western Blot检测细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1、SIRT3的蛋白表达水平。相应试剂盒测定各组肌细胞氧化应激相关指标，即超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性，还原型谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化物酶（LPO）的含量；DHE荧光探针检测各组肌细胞活性氧簇（ROS）的含量。多样本间比较采用完全随机设计单因素方差分析，两样本间比较采用t检验。 结果： 1.L6成肌细胞分化成功鉴定 与未分化组细胞相比，分化组细胞Desmin、Myogenin的mRNA表达含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示L6成肌细胞分化成功； 2.L6成肌细胞IR体外模型的建立 采用0.4mmol/L棕榈酸的培养基孵育细胞24小时后，PA组细胞内葡萄糖浓度为20.46±1.52mmol/L，较Con组细胞内葡萄糖浓度（14.36±1.38mmol/L）升高，差异具有统计学差异（P＜0.05），提示胰岛素敏感性下降，IR模型建立成功； 3.CCK8法检测药物干预对肌细胞增殖的影响 与Con组相比，不同浓度PA组分别作用24h后，均能够升高肌细胞抑制率，降低增殖率，最终选取0.4mmol/L为合适的PA浓度；与PA组相比，0.5、1.0、2.0mmol/L浓度的Met均使肌细胞增殖率增加，然而并没有恢复至Con组水平，超过2mmol/L的Met浓度反而造成肌细胞增殖率下降，最终选取的合适的Met浓度为2mmol/L； 4.肌细胞转染鉴定 各组SIRT3的表达：与Con组相比，PA组SIRT3 mRNA和蛋白表达显著减少（P＜0.05）；与PA组相比，PA+Met组SIRT3 mRNA和蛋白表达均明显增加（P＜0.05）；与PA+siRNA组相比，PA+siSIRT3组肌细胞SIRT3 mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.05）；与PA+Met+siRNA组相比，PA+Met+siSIRT3组肌细胞SIRT3 mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.05），表明SIRT3 siRNA转染成功； 5.肌细胞自噬水平 5.1.自噬相关指标mRNA表达水平的变化 与Con组相比， PA组LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表达水平下降， p62 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PA组相比， PA+Met组干预后显著上调LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表达，明显减少p62 mRNA表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PA+siRNA组相比， PA+siSIRT3组LC3Ⅱ mRNA表达水平进一步降低（P＜0.05），Beclin1 mRNA表达下降、p62 mRNA表达升高，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）；与PA+Met+siRNA组相比，PA+Met+siSIRT3组LC3Ⅱ、Beclin1 mRNA表达水平进一步降低，p62 mRNA表达水平进一步升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）； 5.2.自噬相关分子的蛋白表达水平变化 与Con组相比，PA组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH均显著降低， p62/GAPDH显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与PA组相比， PA+Met组干预后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的比值明显升高， p62/GAPDH明显减低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与PA+siRNA组相比，PA+siSIRT3组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白表达水平进一步降低，Beclin1/GAPDH的蛋白表达下降、p62/GAPDH的蛋白表达升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与PA+Met+siRNA组相比，PA+Met+siSIRT3组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1/GAPDH的蛋白表达水平进一步降低，p62/GAPDH的蛋白表达水平进一步升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）； 6.肌细胞氧化应激 6.1.活性氧（ROS）含量 用DHE荧光探针孵育各组细胞，荧光显微镜下的观察结果显示，与Con组相比，PA组细胞内红色荧光的强度明显增强，表明细胞内ROS含量显著升高；二甲双胍组细胞内荧光强度明显减弱，提示ROS生成减少。与PA+siRNA组相比，PA+siSIRT3组细胞内的红色荧光进一步明显增强；与PA+Met+siRNA组相比，PA+Met+siSIRT3组细胞内ROS含量也进一步增加； 6.2.SOD、CAT活性及GSH、LPO含量测定 L6肌细胞经棕榈酸刺激后，抗氧化酶SOD、CAT的活性较Con组均明显下降（P＜0.05），GSH含量明显降低（P＜0.05），LPO含量明显增加（P＜0.05）；PA+Met组LPO含量较PA组明显减少（P＜0.05）， SOD活性、GSH含量明显增加（P＜0.05），CAT活性增加（P＞0.05）。PA+siSIRT3组SOD的活性较PA+siRNA组进一步明显下降（P＜0.05）， LPO含量进一步明显增加（P＜0.05），CAT活性、GSH含量进一步降低（P＞0.05）；PA+Met+siSIRT3组SOD、CAT的活性较PA+Met+siRNA组进一步明显下降（P＜0.05），GSH含量进一步降低（P＞0.05），LPO含量进一步增加（P＞0.05）。 结论： 1.髙脂孵育能够降低肌细胞葡萄糖摄取率及胰岛素敏感性，同时伴有SIRT3表达下降；二甲双胍干预能够改善肌细胞的胰岛素抵抗程度，同时伴有SIRT3表达升高。 2.二甲双胍能够提高髙脂培养肌细胞内自噬水平，减少ROS生成，恢复SOD、CAT等抗氧化酶的活性，提高GSH含量，降低LPO水平，从而改善胰岛素抵抗。 3.下调SIRT3表达后，二甲双胍增强髙脂培养肌细胞内自噬水平作用减弱，改善氧化应激的作用进一步减弱，SIRT3在其中起到非常重要的作用。