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动物肺组织受到细菌和病毒感染时,机体内的免疫细胞会发生应急反应,以抵抗感染。但该应急反应过多,会引起肺组织损伤,导致肺部炎症和急性肺损伤(ALI),甚至会导致急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。免疫细胞在肺部的募集是一个有序的过程,中性粒细胞是第一波反应的免疫细胞,感染后1~2小时在肺部募集。募集后的中性粒细胞,跨内皮细胞层迁移进入肺泡,释放可对抗入侵细菌和病毒的物质。单核细胞则是在感染24~48小时后第二波在肺部募集的免疫细胞,进入肺组织后的单核细胞可分化为巨噬细胞和树突细胞。巨噬细胞可通过极化发挥促炎或抗炎作用,但目前在肺损伤中这种作用还不明确。ICAM-1作为细胞的黏附分子,在中性粒细胞募集时表达迅速增加,介导中性粒细胞黏附在毛细血管壁上,穿越血管内皮层而浸润到肺组织中。浸润的中性粒细胞及受影响的内皮细胞和巨噬细胞,分泌单核细胞趋化因子MCP-1进一步诱导单核细胞在肺组织的募集。mi RNA(micro RNA)是小RNA的一种,通过靶向m RNA降解或抑制蛋白的翻译,在多种生物学过程中发挥关键作用。有研究表明,肺组织中mi RNA可以影响MCP-1的表达,而ICAM-1是否能通过mi RNA影响MCP-1的表达,目前还不是很清楚。本研究选取小鼠单核巨噬细胞作为研究对象,试图探讨ICAM-1在肺组织中是否通过mi RNA调节趋化因子MCP-1的表达,及其对巨噬细胞极化的影响。研究内容如下:1.ICAM-1敲除对MCP-1和mi R-124表达的影响首先我们在ICAM-1敲除小鼠的肺组织中,发现MCP-1的蛋白表达量增加。选择小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)转染ICAM-1的si RNA,细胞中ICAM-1的表达被抑制后,提高了MCP-1的蛋白表达。ICAM-1敲除的小鼠肺组织,经小RNA测序后,发现mi R-124的表达显著降低,RT-PCR进一步验证了测序结果。2.mi RNA-124靶基因的验证经生物信息学软件预测mi R-124在小鼠肺组织的靶点,发现mi R-124能与MCP-1的3’UTR序列互补结合,MCP-1是mi R-124潜在的靶基因。构建包含MCP-13’UTR的野生型、突变型和缺失型双荧光素酶质粒,经荧光素酶活性分析,表明MCP-1是mi R-124的靶基因。mi R-124模拟物或抑制剂转染小鼠单核巨噬细胞,RT-PCR和Western blot检测MCP-1的表达,发现mi R-124能抑制MCP-1的转录与翻译。3.转录因子SP-1对mi R-124的转录调控为了研究mi R-124表达的分子机制,克隆小鼠mi R-124的启动子序列,构建于PGL3-Basic载体中,在小鼠单核巨噬细胞中验证其启动子的活性,通过荧光活性分析证实启动子pre-493区域内含有激活mi R-124转录的转录因子。生物信息学分析结合位点,预测SP-1与mi R-124可能结合的位点。经转录位点突变和凝胶迁移实验,确定了SP-1对mi R-124的关键作用位点和两者的相互结合。4.mi R-124、ICAM-1调控巨噬细胞极化LPS(2μg/m L)和IL-4(20ng/m L)分别处理小鼠单核巨噬细胞,构建极化模型。我们发现LPS诱导细胞分化为M1型,IL-4诱导细胞分化为M2型。将mi R-124的模拟物和ICAM-1 si RNA分别转染单核巨噬细胞,检测M1/M2型巨噬细胞的标志分子。我们发现ICAM-1和mi R-124具有促进M2型极化的作用,促进标志分子ym-1、Mrc-1和IL-10的表达。表明mi R-124和ICAM-1具有抗炎作用,能抑制小鼠单核细胞中的炎性反应。5.mi R-124对动物体内肺损伤的作用本研究通过LPS(10mg/kg)诱导体内肺损伤的炎症模型,确认mi R-124对肺损伤的作用。将mi R-124(2OD)尾静脉注射小鼠,RT-PCR检测mi R-124在肺组织中的表达增加。然后用LPS诱导小鼠肺损伤,检测肺髓过氧化物酶活性(MPO),与单独LPS诱导的小鼠相比,mi R-124抑制了MPO的活性,对肺损伤起到了保护的作用。PRRSV感染的猪肺组织中,我们发现ICAM-1和mi R-124的表达上调,MCP-1的表达下调。表明在PRRSV造成的猪肺损伤组织中,ICAM-1、mi R-124与MCP-1的表达负相关,积极参与猪肺组织中的炎症反应。综上所述,本研究通过对比野生型小鼠和ICAM-1敲除小鼠中MCP-1的表达,经mi RNA测序,差异表达分析发现潜在调控MCP-1的mi RNA,阐明ICAM-1能通过mi R-124调节趋化因子MCP-1的蛋白表达来控制单核细胞在肺部的募集。ICAM-1不仅是炎症反应分子,还能调节MCP-1的蛋白表达,影响肺部组织的免疫反应。转录因子SP-1能激活mi R-124的转录。在巨噬细胞中过表达mi R-124能促进巨噬细胞M2型极化,具有抗炎作用,同时对LPS诱导的肺损伤起保护作用,为深入研究与肺部炎症和损伤相关的病理生理机制提供研究基础。