研究背景:熊去氧胆酸（Ursodeoxycholic Acid,UDCA）是熊胆粉中的有效成分之一。研究表明UDCA对于缺氧引起细胞损伤具有保护作用。同时实验提示UDCA具有保护肝胆,促进肝胆管分泌的作用。经动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization,TACE）是目前治疗不能手术切除肝癌患者或术后复发肝癌患者主要的治疗方法。然而由于TACE术后肿瘤坏死不彻底、促血管生长因子分泌增多促进血管新生等问题使TACE的远期效果欠佳。缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIF）-1α能够作用于下游靶基因,上调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,促进肿瘤血管的生成。因此,这些研究提示我们:TACE治疗肝癌后,肿瘤组织内部绝对缺氧的微环境中HIF-1α的高表达能够通过促进VEGF的表达与血管新生,进而促进肝癌的复发、浸润及转移密切。研究目的:明确UDCA是否能够抑制肝癌缺氧微环境中血管生成,并通过HIF-1α/VEGF等信号通路进一步探讨UDCA抑制血管生成的作用机制。研究方法:1、MTT法检测人HCC细胞系Huh 7和人内皮细胞系EA.hy 926细胞增殖情况。将Huh 7细胞或EA.hy 926细胞分别用25、50、100、200和400μM UDCA处理24 h或48 h,然后进行MTT分析以评估UDCA的抗增殖作用。EA.hy 926细胞与分别用50μM Co CL₂和50μM UDCA处理的Huh 7细胞共培养,并进行MTT分析以评估EA.hy 926细胞的增殖。2、小管形成实验检测缺氧条件下UDCA对于Huh 7细胞的小管形成的影响。EA.hy 926细胞空白或与Huh 7细胞共培养,分别用50μM Co CL₂和25、50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养,进行小管形成实验,用Image J计算结点数,总段长度和平均网格大小,以量化管的形成。3、RT-PCR检测检测缺氧条件下UDCA处理后Huh 7细胞IL-8和VEGF的m RNA表达。Huh 7细胞用25、50μM UDCA或50μM Co CL₂,50μMCo CL₂+25μM UDCA,50μM Co CL₂+50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养24 h后,采用RT-PCR检测IL-8和VEGF的m RNA。4、酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）缺氧条件下UDCA处理的Huh 7细胞VEGF和IL-8浓度蛋白水平。Huh 7细胞用25、50μM UDCA或50μM Co CL₂,50μM Co CL₂+25μM UDCA,50μM Co CL₂+50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养24 h后,使用ELISA测定VEGF和IL-8蛋白浓度水平。5、小管形成实验检测UDCA在体外对IL-8诱导小管形成的作用。用100 ng/m L IL-8和不同剂量的UDCA（25和50μM）处理EA.hy 926细胞,并用Image J计算管形成和连接数,总片段长度和均值网格尺寸。6、基质胶栓塞体内血管生成测定UDCA在体内对IL-8诱导的管形成中的作用。体内测定中各组基质胶塞的代表性图像,测定的基质胶塞的血红蛋白含量。显示了使用来自各组的CD31,VEGF和v WF抗体的HE染色和IHC染色的代表性图像。7、RT-PCR检测HIF-1α的m RNA。Huh 7细胞用25、50μM UDCA或50μM Co CL₂,50μM Co CL₂+25μM UDCA,50μM Co CL₂+50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养24 h,应用RT-PCR检测HIF-1α的m RNA。8、Western Blot测定HIF-1α的蛋白水平。Huh 7细胞用25、50μM UDCA或50μM Co CL₂,50μM Co CL₂+25μM UDCA,50μM Co CL₂+50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养24 h,Western Blot测定HIF-1α的蛋白水平。9、双重荧光素酶报告基因分析UDCA处理转染HIF质粒的Huh 7细胞或Huh 7细胞。用UDCA处理转染了HIF质粒的Huh 7细胞或Huh 7细胞,并进行双重荧光素酶报告基因分析,每组的相对荧光强度表示为萤火虫荧光强度/海肾荧光强度（DF）的比值。10、RT-PCR分析检测转染HIF质粒的Huh 7细胞或Huh 7细胞经UDCA处理后的IL-8和VEGF的m RNA。将Huh 7细胞用HIF质粒转染,并用50μM UDCA处理24 h,然后应用RT-PCR分析检测IL-8和VEGF的m RNA。11、ELISA测定缺氧条件下HIF过表达和UDCA干预的Huh 7细胞VEGF和IL-8浓度水平。确定HIF过表达和UDCA干预的Huh 7细胞的VEGF和IL-8浓度。12、小管形成实验检测缺氧条件下转染HIF质粒Huh 7细胞经UDCA处理后对于小管形成的影响。EA.hy 926细胞空白或与Huh 7细胞共培养,将其转染HIF质粒并在Co CL₂存在下用25,50μM UDCA处理或在低氧培养箱中培养,进行小管形成实验,并使用Image J计算结点的数量,总段长度和平均网格大小以量化管形成。13、Western Blot法检测p-P65,p-ERK,ERK,p-AKT和AKT的表达。Huh 7细胞分别用25、50μM UDCA或50μM Co CL₂,50μMCo CL₂+25μMUDCA,50μMCo CL₂+50μMUDCA处理或在低氧培养箱中培养24 h,然后用Western Blot法检测p-P65,p-ERK,ERK,p-AKT和AKT的表达。用IL-8或IL-8+UDCA处理2 h或4 h,检测细胞质P65（C-P65）和核P65（N-P65）。用IL-8或IL-8+UDCA处理15、30或60分钟,检测p-ERK,ERK-8。14、RT-PCR法检测在Co CL₂或缺氧培养箱条件下转染P65质粒并经UDCA处理后的Huh 7细胞HIF-1α的m RNA表达。经Co CL2或缺氧培养箱处理,将P65质粒转染到Huh 7细胞中,经UDCA处理,通过RT-PCR检测HIF-1α的m RNA表达。研究结果:1、通过MTT法显示:UDCA在高剂量（>100μM）下显著抑制Huh 7和EA.hy926细胞的活力。在有或没有Co CL₂（50μM）的情况下,用UDCA（50μM）处理24 h不会影响EA.hy 926细胞的生存能力。与Huh 7细胞共培养可显著提高EA.hy 926细胞的活力。在Huh 7细胞中,UDCA,Co CL₂和Co CL₂+UDCA也不会影响EA.hy 926细胞的生存能力。2、小管形成实验:在常氧条件下,与Huh 7细胞共培养不能促进EA.hy 926细胞的小管形成（P>0.05）。在Co CL₂处理下或在低氧培养箱中,与Huh 7细胞共培养可显著增加EA.hy 926细胞的小管形成（P<0.05）。UDCA（25和50μM）在缺氧条件下拮抗Huh 7细胞对EA.hy 926细胞管形成的影响。3、通过RT-PCR检测IL-8和VEGF的m RNA表达表达。在正常氧条件下,对照组和UDCA组之间的Huh 7细胞中IL-8和VEGF m RNA没有显著变化。Co CL₂处理明显上调IL-8和VEGF的m RNA表达。25和50μM的UDCA均抑制Co CL₂诱导的IL-8和VEGF m RNA的上调。在缺氧条件下,与正常氧条件下相比,Huh 7细胞中IL-8和VEGF m RNA的表达也显著增加,这也受到UDCA的抑制。4、ELISA结果显示,在Co CL₂或缺氧处理后,VEGF和IL-8的蛋白水平也显著升高,UDCA可以部分逆转VEGF和IL-8的蛋白水平升高。5、IL-8组中,与对照组相比,结点数,总节段长度和平均网格尺寸显著增加（P<0.05）。UDCA处理（25和50μM）在体外显著抑制IL-8诱导的小管形成。6、通过基质胶塞血管生成测定,在体内,IL-8组的血红蛋白含量高于对照组。UDCA治疗显著降低了血红蛋白含量（P<0.05）。此外,HE染色显示,IL-8组中新形成的血管比对照组多,而UDCA使新生血管减少。此外,IL-8组中CD31,VEGF和v WF的表达上调并被UDCA抑制。7、通过RT-PCR检测和Western Blot法检测,Co CL₂和缺氧均上调HIF-1αm RNA和蛋白的表达,而UDCA能够抑制缺氧诱导的HIF-1αm RNA和蛋白的表达。相反,在常氧条件下用25和50μMUDCA处理时,HIF-1αm RNA没有变化。8、通过双重萤光素酶报告基因检测分析,在常氧条件下,UDCA处理后,Huh 7细胞的相对荧光素酶活性保持较低水平。在Co CL₂和缺氧条件下,缺氧反应元件（hypoxia responseelements,HRE）活性显著提高,而UDCA则部分抑制了这种作用。在常氧与低氧条件下,用HIF-1α载体对照转染均没有明显改变HRE活性。当用Co CL₂处理或在缺氧培养箱中孵育时,UDCA抑制Huh 7细胞的HRE活性（与对照或载体对照相比,P<0.05）。在缺氧条件下表达HIF-1α的细胞中荧光素酶活性增加了约13倍。用UDCA治疗后,HRE驱动的荧光素酶活性被显著抑制（P<0.05）。结果表明UDCA通过抑制HIF-1α表达进而抑制HRE活性。9、RT-PCR和ELISA结果显示,在常氧条件下,UDCA对IL-8或VEGF的表达影响很小。低氧状态下IL-8和VEGF均被显著上调（P<0.05）。用HIF质粒转染后,这种作用明显增强。缺氧条件下UDCA能够显著抑制Huh 7细胞中IL-8和VEGF的过表达。10、通过小管形成实验结果表明,常氧或缺氧条件下HIF-1α转染可显著促进管形成,在常氧或缺氧条件下,25和50μM UDCA均可抑制HIF-1α转染促管形成。UDCA对HIF-1α信号的抑制可通过下调IL-8和VEGF的表达来实现。11、通过Western Blot法检测发现Co CL₂和低氧培养箱均可明显上调P65,ERK和ATK的磷酸化表达,而P65,ERK和ATK的总蛋白变化较小。在正常状态下,通过UDCA处理后,p-P65,p-ERK和p-AKT的变化较小。IL-8处理2 h或4小时后,IL-8会增加细胞核中P65的表达,但会减少细胞质中P65水平,并且这种作用能被UDCA抑制,IL-8干预4小时更为明显。IL-8处理15-60分钟能促进ERK的磷酸化,并呈时间依赖性。12、通过RT-PCR检测证实,在缺氧条件下,P65的过度表达进一步上调HIF-1α的m RNA的表达,这能被UDCA的抑制。结论:1、缺氧条件下UDCA抑制肝癌细胞诱导的血管生成。2、缺氧条件下UDCA抑制肝癌细胞诱导的IL-8和VEGF的上调。3、UDCA在体外和体内抑制IL-8诱导的管形成。4、缺氧条件下UDCA抑制HIF信号传导,并通过抑制HIF-1α表达抑制HRE活性。5、UDCA对血管生成的抑制作用是通过阻断HIF/IL-8和VEGF信号通路来介导的。6、缺氧条件下UDCA抑制NFκB和MAPK活化抑制肝癌血管生成。