猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及ORF2基因的原核表达

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猪圆环病毒2型(Porcine circovurus type 2,PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome)等相关疾病的重要病原。利用PCR技术对全国9个省规模化猪场发病猪群进行了PCV2检测,并完成了41株:PCV2毒株的全基因组序列测定与分析。PCV2的ORF2基因不仅是其主要结构蛋白的编码基因,而且也是区分PCV1和PCV2的重要区域,其编码蛋白具有良好的抗原性。利用PCR技术扩增出PCV2 FJ株ORF2基因,并进行了诱导表达,成功实现了ORF2基因在大肠杆菌中的表达。 采用PCR技术,对PCV2阳性病料进行全基因的扩增、克隆和测序,得到1768bp或1767bp的目的基因片段。应用DNAstar序列分析软件对所测定的41株PCV2序列进行同源性分析。结果显示,我国PCV2流行毒株之间有很高的同源性(93.7%-100%)。从系统发育进化树可以看出,我国PCV2流行毒株与美洲、欧洲和亚洲等国家的PCV2代表株也有很近的亲缘关系。PCV2流行毒株的亲缘关系与地域之间没有十分密切的联系。应用计算机分析两个主要阅读框ORF1和ORF2并推导其氨基酸序列,其中ORF1的核苷酸及氨基酸之间的同源性分别为96.4%~100%和96.5%~99.7%,说明ORF1非常保守,这与其编码蛋白的功能有关。ORF2之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为86.3%-99.6%和88.2%~100%,变异相对于ORF1较大,与国外已发表毒株的ORF2比较,发现变异主要发生在三个区域,其中两个与病毒的抗原表位相对应,推测这些变异可能与PCV2抗原性及致病性的改变有关。 采用PCR方法从已构建好的PCV2全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,亚克隆到表达载体pET-32a中,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。
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